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酵素阻害

シトクロムP450 (CYP) およびUGT酵素の阻害は、臨床的に関連する薬物間相互作用の主な原因です。 試験品の阻害能は、プールされたヒト肝ミクロソームベースのインキュベーションにおけるヒトCYP酵素の選択的プローブ基質の代謝に対するその効果を決定することによって評価されます。 阻害性酵素動態をさらに特徴付けることができ、その結果のデータは、薬物の投与後に臨床的に重要なDDIが発生する可能性があるかどうかを予測するために使用されます。

  • FDAおよびEMAが推奨する試験

  • 細胞毒性および安定性アッセイ

  • CYP mRNAおよび酵素誘導

酵素阻害研究における規制上の考慮事項

これらの研究は、ファーストインヒューマン試験に進む前に、可逆的(直接的)および不可逆的(時間依存的)のシトクロムP450阻害の両方に関するデータを生成するために、FDAとEMAの両方の薬物間相互作用(DDI)ガイドラインで推奨されています。 阻害データは、臨床DDI研究の要件と範囲を決定するために使用されます。

方法

  • テストシステム: プールされたヒト肝臓ミクロソーム(HLM)
  • 評価されたCYP酵素: CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1およびCYP3A4/5
  • ご要望に応じて直接阻害アッセイで評価されたUGT酵素: UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT11A6、UGT1A9、UGT2B7、UGT2B15 
  • 試験品濃度: 8つの濃度を3重に
  • すべてのサンプル前処理とインキュベーションは、Hamilton Microlab Star自動リキッドハンドリングシステムを使用して実行されます

 

CYP阻害は、直接アッセイと依存アッセイの両方で測定されます。 各CYP酵素の最大反応速度(Km)の半分を達成する基質濃度で、CYP選択的基質が使用されます(以下を参照)。 既知の阻害剤は、直接阻害アッセイと代謝依存性阻害アッセイの両方のポジティブコントロールとして使用されます。 すべてのインキュベーションは、CYP基質に特異的な安定標識内部代謝産物標準を含む冷却アセトニトリルの添加によって終了します。

時間依存性(不可逆的)阻害

8濃度の試験品を使用したアッセイを、NADPHの非存在下および存在下で30分間インキュベートしてから、プローブ基質アッセイ混合物に希釈します。 顕著な時間依存性阻害が観察された場合、不活性化定数 (kinact) や阻害定数 (KI) などの追加の速度論的パラメーターを決定できます。 これらのパラメータは、プレインキュベーション時間と阻害剤濃度を変化させて実験的に決定され、薬物間相互作用の可能性を明らかにするのに役立ちます。 

直接阻害

アッセイは、阻害の可能性を評価し、可能な場合はIC50を定義するために、8つの濃度の試験品の存在下および非存在下で実行されます。

直接阻害は、5つの濃度のプローブ基質を使用して、阻害定数 (Ki) と観察された阻害の種類を決定することによってさらに特徴付けることができます。

シトクロムP450基板分析物直接阻害時間依存性抑制
CYP1A2フェナセチンアセトアミノフェンフルボキサミンフラフィリン
CYP2B6ブプロピオンヒドロキシブプロピオンオルフェナドリンチオテパ
CYP2C8アモジアキンデセチルアモジアキンモンテルカストゲムフィブロジル1-O-β-グルクロニド
CYP2C9ジクロフェナク4'-ヒドロキシジクロフェナクスルファフェナゾールチエニリック酸
CYP2C19メフェニション4'-ヒドロキシメフェニションヌートカトンエソメプラゾール
CYP2D6デキストロメトルファンデキストロルファンキニジンパロキセチン
CYP3A4/5テストステロン6β-ヒドロキシテストステロンケトコナゾールエリスロマイシン
CYP3A4/5ミダゾラム1'-ヒドロキシミダゾラムケトコナゾールトロレアンドマイシン

 

成果物

これらのアッセイは、CYP酵素の直接的または不可逆的な阻害のIC50  値を提供します。 有意な直接阻害が観察される場合は、阻害定数(Ki)が決定される可能性があります。 有意な時間依存性阻害が観察された場合、メカニズムベースの不活性化パラメータ(KI およびkinact)を決定することができます。 これらのパラメーターを使用すると、ファーマコメトリックスにより、臨床試験の必要性を評価する際に追加のガイダンスが得られる可能性があります。