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효소 억제

시토크롬 P450(CYP) 및 UGT 효소의 억제는 임상적으로 관련된 약물 간 상호작용의 주요 원인입니다. 시험 물질의 저해 잠재력은 인간 간 미세소체 기반 배양액을 모아 인간 CYP 효소에 대한 선택적 프로브 기질의 대사에 미치는 영향을 결정함으로써 평가됩니다. 저해 효소 반응 속도를 더욱 자세히 특성화하고, 그 결과 얻은 데이터를 사용하여 약물 투여 후 임상적으로 중요한 DDI가 발생할지 여부를 예측할 수 있습니다.

  • FDA 및 EMA 권장 연구

  • 세포독성 및 안정성 분석

  • CYP mRNA 및 효소 유도

효소 억제 연구에 대한 규제 고려 사항

이러한 연구는 최초 인체 시험에 들어가기 전에 가역적(직접적) 및 비가역적(시간 의존적) 시토크롬 P450 억제에 대한 데이터를 생성하기 위해 FDA와 EMA의 약물-약물 상호작용(DDI) 가이드라인에서 권장됩니다. 억제 데이터는 임상 DDI 연구의 요구 사항과 범위를 결정하는 데 사용됩니다.

방법

  • 테스트 시스템: 풀링된 인간 간 미세소체(HLM)
  • 평가된 CYP 효소: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 및 CYP3A4/5
  • 요청에 따라 직접 저해 분석에서 평가된 UGT 효소: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT11A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15 
  • 시험 물질 농도: 8가지 농도를 3회 반복
  • 모든 샘플 준비 및 배양은 Hamilton Microlab Star 자동 액체 취급 시스템을 사용하여 수행됩니다.

 

CYP 억제는 직접 분석과 종속 분석 모두에서 측정됩니다. CYP 선택적 기질은 각 CYP 효소에 대한 최대 반응 속도(Km)의 절반을 달성하는 기질 농도에서 사용됩니다(아래 참조). 알려진 억제제는 직접 및 대사 의존적 억제 검정 모두에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다. 모든 배양은 CYP 기질에 특이적인 안정적으로 표지된 내부 대사산물 표준을 포함하는 냉각된 아세토니트릴을 첨가하여 종료됩니다.

시간 의존적(비가역적) 억제

시험 물질의 8가지 농도를 사용한 검정은 탐침 기질 검정 혼합물에 희석하기 전에 30분 동안 NADPH가 없는 상태와 있는 상태에서 배양합니다. 눈에 띄는 시간 의존적 억제가 관찰되면 비활성화 상수(kinact)와 억제 상수(KI)를 포함한 추가적인 동역학 매개변수를 결정할 수 있습니다. 이러한 매개변수는 사전 배양 시간과 억제제 농도를 변화시켜 실험적으로 결정되며, 약물 간 상호작용의 가능성을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 

직접 억제

시험 물질의 8가지 농도가 존재하거나 존재하지 않는 상황에서 시험을 수행하여 저해 가능성을 확인하고 가능한 경우 IC50을 정의합니다.

직접 저해는 5가지 농도의 프로브 기질을 사용하여 저해 상수(Ki)와 관찰된 저해 유형을 결정함으로써 더욱 자세히 특성화할 수 있습니다.

시토크롬 P450기판분석물직접 억제시간 의존적 억제
CYP1A2페나세틴아세트아미노펜플루복사민푸라필린
CYP2B6부프로피온히드록시부프로피온오르페나드린티오테파
CYP2C8아모디아퀸데세틸라모디아퀸몬테루카스트젬피브로질 1-O-β-글루쿠로니드
CYP2C9디클로페낙4'-하이드록시디클로페낙설파페나졸티에닐산
CYP2C19메페니션4'-하이드록시메페니션누트카톤에소메프라졸
CYP2D6덱스트로메토르판덱스트로르판키니딘파록세틴
CYP3A4/5테스토스테론6β-하이드록시테스토스테론케토코나졸에리스로마이신
CYP3A4/5미다졸람1'-하이드록시미다졸람케토코나졸트롤레안도마이신

 

성과물

이러한 분석은 CYP 효소의 직접적 또는 비가역적 억제에 대한 IC50 값을 제공합니다. 상당한 직접적 억제가 관찰되면 억제 상수(Ki)를 결정할 수 있습니다. 시간에 따라 상당한 억제가 관찰되면 메커니즘 기반 비활성화 매개변수(KI 및 kinact)를 결정할 수 있습니다. 이러한 매개변수를 이용하면 약리측정학은 임상 시험의 필요성을 평가할 때 추가적인 지침을 제공할 수 있습니다.