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薬物間相互作用とトランスポーター

体内の多くのバリア組織に位置する膜薬物トランスポーターは、薬物と相互作用してin vivoでの吸収、分布、排泄に影響を与える可能性があり、臨床的に関連する薬物間相互作用 (DDI) の原因となります。 トランスポーターの基質または阻害剤としての被験物質の同定は、併用投与された薬物の臨床的に関連する曝露の変化および毒性を説明できます。 薬物の腸内透過性は、吸収される画分を駆動する重要な要因であり、Caco-2単層輸送アッセイを使用して評価できます。

トランスポーター相互作用に関する規制上の考慮事項

これらの研究は、ファースト・イン・ヒューマン試験に入る前にトランスポーター相互作用を評価するために、FDAとEMAの両方の薬物間相互作用 (DDI) ガイドラインで推奨されています。 トランスポーター研究では、薬物が吸収または分布に及ぼす影響により、併用投与された薬物の有効な血漿濃度を達成する際の潜在的な問題が浮き彫りになっています。

いくつかのトランスポーターは、臨床使用中の薬物と相互作用します。 テストに推奨されるものは次のとおりです。

  • ATP結合カセット (ABC) 排出トランスポーターP-糖タンパク質 (P-gp)、乳がん耐性タンパク質 (BCRP)、および胆汁塩輸出ポンプ (BSEP)。
  • 溶質担体 (SLC) 取り込みトランスポーター 有機陰イオントランスポーター (OAT) 1 および OAT3、有機陽イオントランスポーター (OCT) 2、有機陰イオン輸送ポリペプチド (OATP) 1B1、OATP1B3、および多剤および毒素押出 (MATE) 1 および MATE2 K。

トランスポーター相互作用の方法

  • テストシステム: 単一取り込み(SLC)トランスポーターまたはベクターコントロールを発現するトランスフェクト細胞株は、5% CO2中、37°Cの加湿インキュベーターで単層培養されています。
  • アッセイバッファー: HEPESを含むHBSS、pH 7.4
  • MATEトランスポーターの場合のみ、細胞はNH4Clで前処理され、MATE取り込み活性に必要なpH勾配を細胞膜に導入します
  • 試験品濃度: 基質アッセイ用に2つ、阻害アッセイ用に2つ
  • 各トランスポーターに特異的な放射性標識プローブ基質
  • 各トランスポーターのポジティブコントロール阻害剤

培養中のトランスポーター発現細胞を、5% CO2を含む37°Cの加湿インキュベーターでアッセイバッファーとともに30分間プレインキュベートします。 MATE発現細胞をNH4Clで処理して、細胞膜を通してpH勾配を作成し、取り込み活性を促進します。 プローブ基質または試験品を3重のウェルに追加し、必要に応じて阻害剤を追加します。 プレートは、トランスポーターに応じて2〜10分間の単一の時間でインキュベートされます。 バッファーは吸引され、細胞は洗浄され、その後溶解、収集され、LC-MSを使用して試験品の存在について分析されます。

基質評価: 各トランスポーター単独または選択的阻害剤の存在下での試験品の取り込みは、2〜5分間のインキュベーション後にベクターコントロールによる取り込みと比較されます。 各トランスポーター単独または選択的阻害剤の存在下およびベクターコントロールによるプローブ基質の取り込みは、コントロールとして実行されます。

阻害剤の評価: 各トランスポーターによるプローブ基質の取り込みは、単独で、または選択的阻害剤または試験品の存在下で行われます。 ベクターコントロールによるプローブ基板の取り込みもコントロールとして実行されます。 阻害が観察された場合、IC50 が決定される可能性があります。

  • テストシステム: Caco-2ヒト腸上皮細胞、Transwellプレート上で5%CO2 で37°Cで21〜24日間培養
  • アッセイバッファー: HEPESを含むHBSS、pH 7.4、頂側室と基底側室の両方で
  • 経内皮電気抵抗 (TEER) は、タイト ジャンクションの形成を確認するためにアッセイの前に測定されます
  • 試験品濃度: 基質アッセイ用に2つ、阻害アッセイ用に2つ
  • 放射性標識透過性マーカーマンニトールとカフェインを使用して、タイトジャンクション形成を検証します
  • 各トランスポーターに固有の放射性標識プローブ基質が使用されます
  • 陰性対照阻害剤を用いた各トランスポーターに対するポジティブコントロール選択的阻害剤

試験品およびプローブ基質の見かけの透過性は、トランスウェルプレートの頂端から基底側(A-B)および基底側から頂端(B-A)方向の両方で決定されます。 5%CO2中で37°Cの加湿インキュベーター内のアッセイバッファーで30分間プレインキュベートした後、プローブまたは試験品を1つのチャンバー(ドナー)に加え、受容側のチャンバー(レシーバー)にブランクバッファーを入れます。 次に、該当する場合は、阻害剤を両方のチャンバーに追加します。 プレートを37°C、5%CO2 中で2時間インキュベートします。 ドナーチャンバーとレシーバーチャンバーのサンプルを収集し、LC-MSを使用して試験品の存在について分析します。 次に、試験品の透過性と流出率が決定されます。

基質評価: 試験品の単独または選択的阻害剤の存在下での輸送は、両方向に決定されます。 各トランスポーターのプローブ基質の輸送は、単独で、または選択的阻害剤の存在下で、対照として実行されます。

阻害剤の評価: プローブ基質の輸送は、2時間のインキュベーション後、単独で、または選択的阻害剤または試験品の存在下で両方向に決定されます。 流出輸送の阻害が観察された場合、IC50 が決定される場合があります。

  • テストシステム: 流出(ABC)トランスポーターBSEPを発現する膜小胞(50μg/ウェル)。
  • 試験品濃度: 基質アッセイ用2、阻害アッセイ用2。
  • アデノシン三リン酸 (ATP) 依存性活性を測定し、アデノシン一リン酸 (AMP) を対照として使用しました。
  • BSEPに特異的な放射性標識プローブ基質
  • 各トランスポーターのポジティブコントロール阻害剤

BSEPを発現する膜小胞と試験品またはプローブ基質を96ウェル プレートでインキュベートします。 取り込みは、アデノシン三リン酸 (ATP) の添加によって開始され、その後37°Cで30分間インキュベートされます。 アデノシン一リン酸 (AMP) は、ネガティブ コントロールとして並行して使用されます。 取り込みは、真空吸引と、余分な氷冷輸送バッファーでフィルターを2回すすぐことによって終了します。 次に、LC-MS定量とATP依存性活性の計算のために、フィルタープレートから小胞を抽出します。

基質評価: ATPの存在下での被験物質単独および選択的阻害剤との取り込みは、AMPの存在下での取り込みと比較されます。  BSEP単独および選択的阻害剤の存在下でのプローブ基質の取り込みが対照として実施されます。

阻害剤の評価: プローブ基質の取り込みは、単独で、選択的阻害剤または試験品の存在下で実施されます。ATPの存在下での取り込みは、AMPの存在下での取り込みと比較されます。  被験物質のATP依存性取り込みの阻害が観察された場合、IC50 を決定できます。

 

成果物

これらのアッセイは、膜薬物トランスポーターとの基質または阻害相互作用を同定し、プロファイリングします。 データは、取り込みおよび/または流出の程度、試験品の透過性、トランスポーター阻害、および該当する場合はIC50 値を記述します。

これらのデータは、併用治療薬との相互作用の可能性に基づいてDDIリスクを評価し、新薬候補のランク付けにも役立つ可能性があります。 相互作用が観察された場合、ファーマコメトリクスは臨床試験の必要性を評価する際に追加のガイダンスを可能にする場合があります。