药物间相互作用和转运蛋白

• 测试系统： 表达单一摄取（SLC）转运蛋白或载体对照的转染细胞系，在 37°C 的加湿培养箱中在 5% CO_{2 中单层生长}。
• 测定缓冲液： 含 HEPES 的 HBSS，pH 7.4
• 仅对于 MATE 转运蛋白，用 NH₄Cl 预处理细胞以在细胞膜上引入 pH 梯度，这是 MATE 摄取活性所必需的
• 测试样品浓度： 2 个用于底物测定，2 个用于抑制测定
• 针对每种转运蛋白的放射性标记探针底物
• 每种转运蛋白的阳性对照抑制剂

在 37°C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 环境下，将表达转运蛋白的细胞与测定缓冲液一起预孵育 30 分钟。 用 NH4Cl 处理表达 MATE 的细胞，以在细胞膜上产生 pH 梯度，以促进摄取活性。 将探针底物或测试物品添加到一式三份的孔中，并在适用的情况下添加抑制剂。 根据转运蛋白的不同，将板孵育 2 到 10 分钟的一个时间点。 缓冲液被吸出，洗涤细胞，然后裂解，收集并使用 LC-MS 分析测试物品的存在。

基材评估： 将测试物品在每个转运蛋白单独或在选择性抑制剂存在下的摄取与载体对照的摄取进行比较，孵育时间为 2-5 分钟后。 将对每个转运蛋白在单独条件下、在选择性抑制剂存在下以及在载体对照条件下对探针底物的摄取进行对照实验。

抑制剂评估： 每个转运蛋白对探针底物的摄取将单独进行，或在选择性抑制剂或测试样品存在的情况下进行。 矢量对照对探针底物的摄取也将作为对照进行。 如果观察到抑制，则可以确定 IC₅₀ 。

• 测试系统： Caco-2 人肠上皮细胞，在 37°C 的加湿培养箱中，在 5% CO₂ 的条件下，在 Transwell 平板中培养 21-24 天
• 测定缓冲液： 含 HEPES 的 HBSS，顶端和基底外侧腔的 pH 值均为 7.4
• 在测定前测量跨内皮电阻（TEER）以确认紧密连接的形成
• 测试样品浓度： 2 个用于底物测定，2 个用于抑制测定
• 放射性标记的渗透性标志物甘露醇和咖啡因用于验证紧密连接的形成
• 使用放射性标记的探针底物，特定于每个转运蛋白
• 用于每种转运蛋白的阳性对照选择性抑制剂和阴性抑制剂对照

在Transwell板上的顶端到基底外侧（A-B）和基底外侧到顶端（B-A）方向上测定测试物品和探针底物的表观渗透率。 在 37°C、5% CO₂的加湿培养箱中的测定缓冲液中预孵育 30 分钟后，将探针或测试品添加到一个腔室（供体）中，并在另一个腔室（受体）中加入空白缓冲液。 然后在适用的情况下将抑制剂添加到两个腔室中。 将板在 37°C 下在 5% CO₂ 中孵育 2 小时。 使用 LC-MS 收集供体和受体室样品并分析测试品的存在情况。 然后测定试品的渗透性和外排率。

基材评估： 将确定测试物品在单独或选择性抑制剂存在情况下的双向运输。 将为每个转运蛋白单独或在选择性抑制剂存在情况下转运探针底物作为对照进行。

抑制剂评估：在单独孵育 2 小时后或在选择性抑制剂或测试物品存在的情况下，将确定探针底物的双向运输。 如果观察到外排转运的抑制，则可以测定 IC50 。

• 测试系统： 表达外排（ABC）转运蛋白 BSEP 的膜囊泡（50 μg/孔）。
• 测试样品浓度： 2 用于底物测定, 2 用于抑制测定。
• 测量三磷酸腺苷（ATP）依赖性活性，使用单磷酸腺苷（AMP）作为对照。
• BSEP 特异性放射性标记探针底物
• 每种转运蛋白的阳性对照抑制剂

表达 BSEP 的膜囊泡和测试物品或探针底物将在 96 孔板中孵育。 将通过添加三磷酸腺苷（ATP）开始摄取，然后在 37°C 下孵育 30 分钟。 单磷酸腺苷（AMP）将同时用作阴性对照。 吸收将通过真空抽吸和用过量的冰冷运输缓冲液冲洗过滤器两次来终止。 然后从滤板中提取囊泡，用于 LC-MS 定量和 ATP 依赖性活性的计算。

基材评估： 将单独使用测试品和在 ATP 存在下使用选择性抑制剂的摄取与在 AMP 存在的情况下的摄取进行比较。  将单独通过 BSEP 和在选择性抑制剂存在的情况下摄取探针底物作为对照实验进行。

抑制剂评估： 探针底物的摄取将单独进行，并在选择性抑制剂或测试品存在的情况下进行；将存在 ATP 时的摄取与存在 AMP 时的摄取进行比较。  如果观察到受试品的 ATP 依赖性摄取受到抑制，则可以测定 IC₅₀ 。