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약물-약물 상호작용 및 수송체

신체의 여러 장벽 조직에 위치한 막 약물 수송체는 약물과 상호 작용하여 생체 내 흡수, 분포 및 제거에 영향을 미칠 수 있으며 임상적으로 관련된 약물-약물 상호 작용(DDI)의 원인이 됩니다. 시험 물질을 수송체의 기질 또는 억제제로 식별하면 동시에 투여되는 약물의 임상적으로 관련된 노출 변화 및 독성을 설명할 수 있습니다. 약물의 장 투과성은 흡수되는 분율을 결정하는 중요한 요소이며, Caco-2 단층 수송 검정법을 사용하여 평가할 수 있습니다.

수송체 상호 작용에 대한 규제 고려 사항

이러한 연구는 최초의 인체 시험에 들어가기 전에 수송체 상호작용을 평가하기 위해 FDA와 EMA의 약물-약물 상호작용(DDI) 가이드라인에서 권장하는 연구입니다. 수송체 연구는 약물이 흡수나 분포에 미치는 영향으로 인해 동시에 투여되는 약물의 효과적인 혈장 농도를 달성하는 데 잠재적인 문제가 있음을 강조합니다.

여러 운반체가 임상적으로 사용되는 약물과 상호 작용합니다. 테스트를 위해 권장되는 항목은 다음과 같습니다.

  • ATP 결합 카세트(ABC) 유출 수송체 P-글리코단백질(P-gp), 유방암 저항성 단백질(BCRP), 담즙산 배출 펌프(BSEP).
  • 용질 운반체(SLC) 흡수 수송체 유기 음이온 수송체(OAT) 1 및 OAT3, 유기 양이온 수송체(OCT) 2, 유기 음이온 수송 폴리펩티드(OATP) 1B1, OATP1B3, 다중 약물 및 독소 배출(MATE) 1 및 MATE2 K.

수송체 상호작용 방법

  • 시험 시스템: 단일 흡수(SLC) 수송체 또는 벡터 제어체를 발현하는 형질전환 세포주를 37°C, 5% CO2의 습도 인큐베이터에서 단층으로 배양합니다.2.
  • 분석 완충액: HEPES가 포함된 HBSS, pH 7.4
  • MATE 수송체의 경우에만 세포는 MATE 흡수 활동에 필요한 세포막을 가로지르는 pH 구배를 도입하기 위해 NH4Cl로 전처리됩니다.
  • 테스트 항목 농도: 기질 분석의 경우 2개, 억제 분석의 경우 2개
  • 각 수송체에 특화된 방사성 표지 프로브 기질
  • 각 수송체에 대한 양성 대조 억제제

수송체를 발현하는 배양된 세포는 37°C, 5% CO2에서 습도가 높은 인큐베이터에서 30분 동안 분석 완충액과 함께 미리 배양됩니다. MATE를 발현하는 세포에 NH4Cl을 처리하여 세포막을 가로지르는 pH 구배를 생성하여 흡수 활동을 촉진합니다. 프로브 기질이나 시험 물질을 3개의 동일한 웰에 첨가하고, 해당되는 경우 억제제를 첨가합니다. 운반체에 따라 플레이트는 2~10분 동안 배양됩니다. 완충액을 제거하고, 세포를 세척한 다음 용해하여 수집하고 LC-MS를 사용하여 시험 물질의 존재 여부를 분석합니다.

기질 평가: 각 수송체에 의한 시험 물질의 흡수는 단독 또는 선택적 억제제 하에서 2~5분 동안 배양한 후 벡터 대조군의 흡수와 비교됩니다. 각 수송체에 의한 프로브 기질의 흡수는 단독 또는 선택적 억제제 하에서 벡터 대조군에 의한 흡수와 함께 대조군으로서 수행됩니다.

억제제 평가: 각 수송체에 의한 프로브 기질의 흡수는 단독으로 또는 선택적 억제제 또는 시험 물질이 존재하는 경우 수행됩니다. 벡터 대조군에 의한 프로브 기질의 흡수도 대조군으로서 수행될 것이다. 억제가 관찰되면 IC50 을 결정할 수 있습니다.

  • 시험 시스템: Caco-2 인간 장내피세포, 습도 조절된 인큐베이터에서 37°C, 5% CO2 에서 21-24일 동안 Transwell 플레이트에서 배양
  • 분석 완충액: HEPES가 포함된 HBSS, 정단 및 기저측 챔버 모두 pH 7.4
  • 내피세포 전기 저항(TEER)은 밀착 접합 형성을 확인하기 위해 검사 전에 측정됩니다. 
  • 테스트 항목 농도: 기질 분석의 경우 2개, 억제 분석의 경우 2개
  • 방사성 표지 투과성 마커인 만니톨과 카페인은 밀착 접합 형성을 확인하는 데 사용됩니다.
  • 각 수송체에 특화된 방사성 표지 프로브 기질이 사용됩니다.
  • 각 수송체에 대한 양성 대조군 선택적 억제제와 음성 억제제 대조군

시험 물질과 탐침 기질의 겉보기 투과성은 트랜스웰 플레이트에서 정단에서 기저외측(A-B) 및 기저외측에서 정단(B-A) 방향으로 결정됩니다. 습도가 높은 인큐베이터에서 37°C, 5% CO2의 분석 완충액에 30분간 예비 배양한 후, 프로브 또는 시험 물질을 한 챔버(공여체)에 넣고 반대쪽 챔버(수용체)에는 공백 완충액을 넣습니다. 그런 다음 해당되는 경우 두 챔버에 모두 억제제를 추가합니다. 플레이트를 37°C, 5% CO2 에서 2시간 동안 배양합니다. 공여체와 수용체 챔버 샘플을 수집하여 LC-MS를 사용하여 시험 물질의 존재 여부를 분석합니다. 그런 다음 시험 물질의 투과성과 유출 비율이 결정됩니다.

기질 평가: 시험 물질의 단독 운반 또는 선택적 억제제의 존재 하에서의 운반은 양방향으로 결정됩니다. 각 수송체에 대한 프로브 기질의 수송은 단독으로 또는 선택적인 억제제의 존재 하에 대조군으로 수행될 것입니다.

억제제 평가:  탐침 기질의 수송은 단독으로 또는 선택적 억제제 또는 시험 물질이 존재하는 상태에서 2시간 동안 배양한 후 양방향으로 결정됩니다.   유출 수송의 억제가 관찰되면 IC50 을 결정할 수 있습니다.

  • 시험 시스템: 유출(ABC) 수송체 BSEP를 발현하는 막 소포(50 µg/웰).
  • 시험 물질 농도: 기질 분석의 경우 2, 억제 분석의 경우 2.
  • 아데노신 삼인산(ATP) 의존적 활동을 측정하였고, 아데노신 일인산(AMP)을 대조군으로 사용했습니다.
  • BSEP에 특화된 방사성 표지 프로브 기질
  • 각 수송체에 대한 양성 대조 억제제

BSEP를 발현하는 막 소포와 시험 물질 또는 프로브 기질을 96웰 플레이트에서 배양합니다. 흡수는 아데노신 삼인산(ATP)을 첨가하여 시작되며, 그 후 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 아데노신 일인산(AMP)은 음성 대조군으로 병행하여 사용됩니다. 흡수는 진공 흡입과 과량의 차가운 수송 완충액으로 필터를 두 번 헹구는 것으로 종료됩니다. 그런 다음 필터 플레이트에서 소포를 추출하여 LC‑MS 정량화와 ATP 의존적 활성을 계산합니다.

기질 평가: ATP가 존재하는 상황에서 시험 물질 단독으로의 흡수와 선택적 억제제와 함께한 흡수를 AMP가 존재하는 상황에서의 흡수와 비교합니다.  BSEP만으로 프로브 기질의 흡수는 선택적 억제제가 존재하는 경우와 함께 대조로 수행됩니다.

억제제 평가: 프로브 기질의 흡수는 단독으로, 선택적 억제제 또는 시험 물질과 함께 수행됩니다. ATP가 존재할 때의 흡수는 AMP가 존재할 때의 흡수와 비교됩니다.    시험 물질의 ATP 의존적 흡수 억제가 관찰되면 IC50 을 결정할 수 있습니다.

 

성과물

이러한 분석법은 막 약물 수송체와의 기질 또는 억제 상호작용을 식별하고 프로파일링합니다. 데이터는 흡수 및/또는 유출의 정도, 시험 항목 투과성, 수송체 억제 및 IC50 값을 설명합니다.

이러한 데이터는 동시 투여되는 치료제와의 상호작용 가능성에 따른 DDI 위험을 평가하고 새로운 약물 후보의 순위를 매기는 데에도 사용될 수 있습니다. 상호작용이 관찰되면 약리측정법 을 통해 임상 시험의 필요성을 평가할 때 추가적인 지침을 제공할 수 있습니다.