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タンパク質結合

薬物が全身循環に侵入し、全身循環に出現した後、遊離および非結合画分のみが薬理学的(または毒物学的)効果を発揮する。 血漿タンパク質結合の程度は、平衡透析によってin vitroまたはex vivoで決定できます; 限外ろ過または超遠心分離。

  • 規制遵守

  • 多様な方法

  • 有効性と安全性の分析

被験物質の赤血球と血漿への分割は、動物およびヒトの血液中でin vitroまたはex vivoで測定できます。 ミクロソームタンパク質結合は、平衡透析によって評価できます。 薬理学的、薬物動態学的、毒物学的データの評価を支援するには、薬物が血漿タンパク質にどのように結合するか、および血液から血漿への分配がどのように機能するかを説明するデータが必要です。 (SEND 3.1もご覧ください)。

血漿タンパク質結合、血液から血漿への分配、およびミクロソームタンパク質結合研究に関する規制上の考慮事項

被験物質の血漿またはミクロソームタンパク質の未結合画分の調査は、臨床薬理学における用量、曝露、有効性、および安全マージンのin vivo薬物動態プロファイルを特徴付けるために重要です。 血漿タンパク質結合の種間評価はIND要件であり、ICH M3(R2) ガイダンスに詳述されています。

方法

  • テストシステム: プールされた血漿は、各種の動物または特定の血漿タンパク質溶液(ヒト血清アルブミン、α1-酸性糖タンパク質、ガンマグロブリンなど)から得られます。
  • 溶解度によって制限されない限り、濃度は既知の臨床曝露 (0.1 – 10X Cmax) の範囲をカバーするように選択されます。
  • 平衡透析
  • 平衡透析は、ハイスループット透析装置 (HTDialysis LLC、Gales Ferry、CT) を使用して実行されます。強化マトリックス(血漿または単離血漿タンパク質)をドナーチャンバーに添加し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を各ウェルのレシーバーチャンバーに追加します。 次に、プレートをガス透過性膜で密封し、37°Cで5% CO2 で指定された時間インキュベートします(下記参照)。 インキュベーション後、各チャンバーからのサンプルは液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)を使用して分析されます。
  • マトリックスの安定性: 試験品は、血漿中およびDPBS中で、5つの特定の時点で単一濃度でインキュベートされます。
  • 平衡化までの時間: 試験品を単一濃度で血漿に添加し、DPBSに対して5つの特定の時点で透析します。
  • タンパク質結合濃度依存性: 試験品を3つの濃度で血漿に添加し、平衡に必要な時間、DPBSに対して透析します。 
  • ワルファリンなどのポジティブコントロールは、並行平衡透析で≥5時間テストされます。
  • 限外ろ過
  • 強化血漿は、分子量カットオフが30,000 Daの限外濾過装置のサンプルリザーバー部分に追加されます。 サンプルは、37°Cおよび2,000 × gで15分間 (またはその他の適切な条件) 遠心分離されます。 遠心分離後、限外濾過液は、試験品および含有量について、初期濃度と比較してLC-MSによって分析されます。 すべてのタンパク質結合測定は3回繰り返して実行されます。 
  • 非特異的結合: 試験品は、2つの濃度でコントロールされた血漿限外濾過液 (PUF) に添加され、限外濾過手順に従って遠心分離されます。 透析液を分析して、試験品の回収率と血漿がない場合の潜在的な非特異的結合を判断します。
  • タンパク質結合濃度依存性: 試験品を5つの濃度で血漿に添加し、限外ろ過手順に従って遠心分離します。 限外濾過液は、試験品のために分析されます。
  • 超遠心分離
  • 強化血漿を超遠心チューブに加え、37°C、223,000 × gで4時間 (またはその他の適切な条件) 遠心分離して、血漿超遠心液を血漿タンパク質から分離します。 遠心分離後、超遠心分離物をLC-MSで分析し、初期濃度と比較します。 
  • 非特異的結合: 試験品を2つの濃度でヒト血漿と血漿限外濾過液 (PUF) に添加し、超遠心チューブで4時間インキュベートします。 マトリックスを分析して、血漿がない状態での試験品の回収率と潜在的な非特異的結合を決定します。
  • タンパク質結合濃度依存性: 試験品を5つの濃度で血漿に添加し、超遠心分離手順に従って遠心分離します。 超遠心分離物は、試験物質のために分析されます。

  • BPP研究は、ヒトを含むさまざまな種の血液中の被験物質のin vitroでの血液から血漿への分配を決定するために使用されます。
  • テストシステム: 各動物種から得られた血液は、少なくとも3人のドナーからプールすることができます。 少なくとも3人のボランティアから採取した人間の血液はプールされません。
  • ヘマトクリット値は、プールされた動物血液サンプルと個々のヒト血液サンプルについて決定されます。
  • 血液は2〜8°Cで保存され、受け取ってから1週間以内に使用されます。 
  • 被験物質を血液に添加し、最初のアリコートを採取します。 強化血液は、示されているように37°Cでインキュベートされます。 インキュベーション後、分析のためにアリコートが取り除かれます。 残りの血液を遠心分離して血漿を得る。アリコートは分析のために収集され、最初のアリコートと比較されます。
  • マトリックスの安定性: 試験品は、最大4つの時点で、単一の濃度で血液中でインキュベートされます。
  • 平衡化までの時間: 試験品は、最大4つの時点で単一の濃度で血液に添加されます。
  • タンパク質結合濃度依存性: 試験品は最大5つの濃度で血液に添加され、平衡時点までインキュベートされます。
  • 放射性標識試験品の場合、血液アリコートは液体シンチレーション計数(LSC)の前に可溶化されます。 非放射性標識試験品の場合、抽出および分析を液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)で行う前に、血液アリコートを溶解します。

  • 試験品がin vitroでヒト肝臓ミクロソームタンパク質に結合する可能性を評価することで、これらのシステムを使用したアッセイで結合していない画分の補正が可能になります。
  • 平衡透析は、ハイスループット透析装置 (HTDialysis LLC、Gales Ferry、CT) を使用して3回繰り返して実行されます。ドナーチャンバーに強化ミクロソームを追加し、各ウェルのレシーバーチャンバーにアッセイバッファーを追加します。 次に、プレートをガス透過性メンブレンで密封し、5% CO2 で37°Cで5時間インキュベートします。 インキュベーション後、各チャンバーからのサンプルは液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)を使用して分析されます。
  • タンパク質結合: ヒト肝臓ミクロソームをリン酸緩衝液中で3つの濃度(0.05、0.1、0.5 mg/mL)に希釈します。 次に、試験品を3つの濃度でミクロソームに添加し、合計9サンプルとなります。 強化マトリックスサンプルをHTDドナーチャンバーに3セット移し、リン酸に対して5時間透析します。
  • ミクロソームの安定性: 前述の強化マトリックスサンプルを37°Cで5%CO2 で0時間および5時間インキュベートします。

 

成果物

血漿タンパク質結合アッセイは、被験物質の結合の程度を特定し、ヒトおよび他の選択された前臨床種における結合率と非結合率、透析平衡までの時間、および濃度依存プロファイルを提供します。 血液から血漿への分配は、分配係数を提供します。 これらのデータを使用して血漿中の遊離画分を計算し、in vivo曝露を補正して、有効性と安全マージンをプロファイルすることができます。  

ミクロソームタンパク質結合アッセイは、IC50や他のパラメーターを補正して、遊離薬物画分を考慮するために、ヒト肝臓ミクロソームタンパク質に試験品が結合する程度を特定します。