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단백질 결합

약물이 전신 순환계에 유입되어 나타난 후에는 자유롭고 결합되지 않은 부분만이 약리학적(또는 독성학적) 효과를 나타낼 수 있습니다. 혈장 단백질 결합 정도는 평형 투석, 초여과 또는 초원심분리를 통해 시험관 내 또는 생체 외에서 확인할 수 있습니다.

  • 규정 준수

  • 다양한 방법

  • 효능 및 안전성 분석

The partitioning of a test article into erythrocytes vs. plasma can be determined in vitro or ex vivo in animal and human blood. Microsomal protein binding can be evaluated by equilibrium dialysis. Data describing the how the drug binds to plasma proteins and how blood-to-plasma partitioning works are required to aid in the evaluation of pharmacological, pharmacokinetic and toxicological data. (Also see SEND 3.1)

혈장 단백질 결합, 혈액-혈장 분할 및 미세소체 단백질 결합 연구에 대한 규제 고려 사항

시험 물질의 혈장 또는 미세소체 단백질의 비결합 분획을 조사하는 것은 임상 약리학에서 복용량, 노출, 효능 및 안전 한계의 생체 내 약동학 프로파일을 특성화하는 데 중요합니다. 혈장 단백질 결합에 대한 종간 평가는 IND 요구 사항이며 ICH M3(R2) 지침에 자세히 설명되어 있습니다.

방법

  • 테스트 시스템: 각 종에서 모은 혈장 또는 특정 혈장 단백질 용액(예: 인간 혈청 알부민, α1-산성 당단백질, 감마글로불린)
  • 농도는 알려진 임상 노출 범위(0.1 – 10X Cmax)를 포함하도록 선택되며, 용해도에 의해 제한되지 않는 한.
  • 평형 투석
  • 평형 투석은 고처리량 투석 장치(HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT)를 사용하여 수행됩니다. 공여 챔버에는 강화 매트릭스(혈장 또는 분리된 혈장 단백질)를 첨가하고, 각 웰의 수용 챔버에는 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS)를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 가스 투과성 막으로 밀봉하고 37°C에서 5% CO2에서 지정된 시간 동안 배양합니다 (아래 참조). 배양 후, 각 챔버의 샘플을 액체크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 사용하여 분석합니다.
  • 매트릭스의 안정성: 시험 물질은 최대 5개 시점까지 단일 농도로 혈장과 DPBS에서 배양됩니다.
  • 평형 시간: 시험물질을 단일 농도로 혈장에 첨가하고 최대 5개 시점 동안 DPBS에 대해 투석합니다.
  • 단백질 결합 농도 의존성: 시험물질을 세 가지 농도로 혈장에 첨가하고 평형에 도달하는 데 필요한 시간 동안 DPBS로 투석합니다. 
  • 와파린과 같은 양성 대조군은 ≥5시간 동안 병렬 평형 투석으로 테스트됩니다.
  • 초여과
  • 강화된 혈장은 분자량 차단값이 30,000Da인 초여과 장치의 샘플 저장 부분에 추가됩니다. 샘플은 37°C, 2,000 × g에서 15분 동안 원심분리됩니다(또는 다른 적절한 조건). 원심분리 후, 초여과액을 LC-MS로 분석하여 시험 물질과 함량을 초기 농도와 비교합니다. 모든 단백질 결합 측정은 3회 반복하여 수행됩니다. 
  • 비특이적 결합: 시험물질을 두 가지 농도의 대조군 플라스마 초여과액(PUF)에 첨가하여 초여과 절차에 따라 원심분리합니다. 투석액을 분석하여 혈장이 없는 상태에서 시험 물질의 회수율과 잠재적인 비특이적 결합을 확인합니다.
  • 단백질 결합 농도 의존성: 시험물질을 5가지 농도로 혈장에 첨가하고 초여과 절차에 따라 원심분리합니다. 초여과액은 시험물질을 분석하기 위해 사용됩니다.
  • 초원심분리
  • 강화된 혈장을 초원심분리관에 넣고 37ºC, 223,000 × g에서 4시간 동안 원심분리합니다(또는 다른 적절한 조건). 이렇게 하면 혈장 초원심분리물과 혈장 단백질을 분리할 수 있습니다. 원심분리 후 초원심분리액을 LC-MS로 분석하여 초기 농도와 비교합니다. 
  • 비특이적 결합: 시험물질을 두 가지 농도의 인간 혈장과 혈장 초여과물(PUF)에 첨가하여 초원심분리관에서 4시간 동안 배양합니다. 이 매트릭스는 혈장이 없는 상태에서 시험 물질의 회수율과 잠재적인 비특이적 결합을 확인하기 위해 분석됩니다.
  • 단백질 결합 농도 의존성: 시험물질을 5가지 농도로 혈장에 첨가하고 초원심분리 절차에 따라 원심분리합니다. 초원심분리액은 시험물질을 분석하기 위해 사용됩니다.

  • BPP 연구는 인간을 포함한 다양한 종의 혈액에서 시험 물질의 시험관 내 혈액-혈장 분배를 확인하는 데 사용됩니다.
  • 테스트 시스템: 각 동물 종에서 채취한 혈액은 최소 3명의 기증자로부터 모을 수 있습니다. 최소 3명의 자원봉사자로부터 채취한 인간의 혈액은 합쳐지지 않습니다.
  • 헤마토크릿 값은 모은 동물 혈액 샘플과 개별 인간 혈액 샘플을 대상으로 측정됩니다.
  • 혈액은 2~8°C에 보관하고, 수령 후 1주일 이내에 가능한 한 빨리 사용합니다. 
  • 시험물질을 혈액에 첨가하고 초기 분량을 채취합니다. 강화된 혈액은 표시된 대로 37°C에서 배양됩니다. 배양 후, 분석을 위해 일정량을 추출합니다. 남은 혈액을 원심분리하여 혈장을 얻고, 분획을 분석을 위해 채취하여 초기 분획과 비교합니다.
  • 매트릭스의 안정성: 시험 물질은 최대 4개 시점 동안 단일 농도로 혈액에 배양됩니다.
  • 평형 시간: 시험 물질은 최대 4개 시점 동안 단일 농도로 혈액에 첨가됩니다.
  • 단백질 결합 농도 의존성: 시험물질을 최대 5가지 농도로 혈액에 첨가하고 평형 시점까지 배양합니다.
  • 방사성 표지된 시험 물질의 경우, 액체 섬광 계수(LSC)를 실시하기 전에 혈액 일부를 용해시킵니다. 비방사성 표지 시험 항목의 경우, 혈액 일부를 추출하기 전에 용해하고 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석합니다.

  • 시험 물질이 시험관 내에서 인간 간 미세소체 단백질에 결합할 가능성을 평가하면 이러한 시스템을 사용하는 분석에서 결합되지 않은 부분을 보정할 수 있습니다.
  • 평형 투석은 고처리량 투석 장치(HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT)를 사용하여 3회 반복 실시합니다. 강화된 마이크로솜을 공여체 챔버에 첨가하고, 각 웰의 수용체 챔버에는 분석 완충액을 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 가스 투과성 막으로 밀봉하고 37°C, 5% CO2 에서 5시간 동안 배양합니다. 배양 후, 각 챔버의 샘플을 액체크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 사용하여 분석합니다.
  • 단백질 결합: 인간 간 미세소체는 인산완충액에 세 가지 농도(0.05, 0.1, 0.5 mg/mL)로 희석됩니다. 그런 다음 시험 물질을 세 가지 농도로 미세소체에 첨가하여 총 9개의 샘플을 얻습니다. 강화된 매트릭스 샘플을 3회씩 HTD 기증자 챔버로 옮기고 인산염에 대해 5시간 동안 투석합니다.
  • 미세소체의 안정성: 위의 강화된 매트릭스 샘플을 37°C, 5% CO₂에서 0시간 및 5시간 동안 배양합니다.

 

성과물

혈장 단백질 결합 검사는 시험 물질의 결합 정도를 파악하고 결합 및 비결합 비율, 투석 평형 시간, 인간 및 기타 선택된 전임상 종에서의 농도 의존성 프로필을 제공합니다. 혈액에서 혈장으로의 분배는 분배 계수를 제공합니다. 이후 이러한 데이터를 사용하여 혈장 내 자유 분율을 계산하고, 이를 통해 생체 내 노출을 교정하여 효능 및 안전 한계를 파악할 수 있습니다.  

미세소체 단백질 결합 검사는 IC50 또는 유리 약물 분율을 고려하기 위한 다른 매개변수를 보정하기 위해 시험 물질이 인간 간 미세소체 단백질에 결합하는 정도를 식별합니다.