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蛋白质结合

药物进入体循环并出现在体循环中后，只有游离和未结合的部分才能产生药理（或毒理学）作用。 血浆蛋白结合的程度可以通过平衡透析在体外或离体测定，超滤或超速离心。

  • 法规遵从性

  • 多种方法

  • 疗效和安全性分析

可以在动物和人类血液中体外或离体确定测试样品在红细胞和血浆中的分配情况。 微粒体蛋白结合可以通过平衡透析来评估。 需要描述药物如何与血浆蛋白结合以及血液与血浆如何分配的数据来帮助评估药理学、药代动力学和毒理学数据。 （另请参阅 SEND 3.1）

血浆蛋白结合、血与血浆分配和微粒体蛋白结合研究的监管注意事项

研究测试物品的血浆或微粒体蛋白未结合部分对于表征临床药理学中剂量、暴露、疗效和安全裕度的体内药代动力学特征至关重要。 血浆蛋白结合的跨物种评估是一项 IND 要求，并在 ICH M3（R2）指南中进行了详细说明。

方法

  • 测试系统： 来自每个物种或特定血浆蛋白溶液的混合血浆（例如，人血清白蛋白、α1-酸性糖蛋白、γ-球蛋白）
  • 选择浓度以涵盖已知的临床暴露范围（0.1–10X Cmax），除非受溶解度限制。
  • 平衡透析
  • 使用高通量透析设备（HTDialysis LLC，Gales Ferry，CT）进行平衡透析。将强化基质（血浆或分离的血浆蛋白）添加到供体室中，同时将 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）添加到每个孔的受体室中。 然后用透气膜密封板，并在 37°C 下在 5% CO2 中孵育指定时间（见下文）。 孵育后，使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析来自每个腔室的样品。
  • 基质稳定性： 将测试物品在血浆和 DPBS 中在单一浓度下于多达五个时间点孵育。
  • 平衡时间： 将测试物品以单一浓度添加到血浆中，并在多达五个时间点进行透析以对抗 DPBS。
  • 蛋白质结合浓度依赖性： 将测试物品以三种浓度添加到血浆中，并在平衡所需的时间内针对 DPBS 进行透析。 
  • 华法林等阳性对照在平行平衡透析中测试时间为 ≥5 小时。
  • 超滤
  • 强化血浆将添加到超滤装置的样品储液器部分，截留分子量为 30,000 Da。 样品将在 37°C 和 2,000 × g 下离心 15 分钟（或其他适当条件）。 离心后，将通过 LC-MS 分析超滤液中的测试物品及其含量，并与初始浓度进行比较。 所有蛋白质结合测定将一式三份进行。 
  • 非特异性结合： 将供试品加入两种浓度的对照血浆超滤液（PUF），并按超滤程序离心。 将分析透析液以确定供试品的回收和在无血浆的情况下潜在的非特异性结合。
  • 蛋白质结合浓度依赖性： 将供试品以五种浓度添加到血浆中，并按照超滤程序离心。 将分析超滤液中的供试品。
  • 超速离心
  • 将强化血浆加入超速离心管中，在 37°C 下以 223,000 × g 离心 4 小时（或其他适当条件），以实现血浆超速离心液与血浆蛋白的分离。 离心后，超速离心液将通过 LC-MS 进行分析，并与初始浓度进行比较。 
  • 非特异性结合： 将供试品以两种浓度加入到对照人血浆和血浆超滤液（PUF）中，并在超速离心管中孵育 4 小时。 将分析基质以确定受试品的回收率以及在无血浆情况下的潜在非特异性结合。
  • 蛋白质结合浓度依赖性： 将受试品以五种浓度加入血浆中，并按照超速离心程序离心。 将分析超速离心产物中的受试品。

  • BPP 研究用于确定受试品在包括人类在内的各种物种血液中的体外血浆分配系数。
  • 测试系统： 从每种动物获得的血液可以从至少三个供体中合并。 从至少三名志愿者那里获得的人血不会被汇集。
  • 确定混合动物血液样本和单个的人类血液样本的血细胞比容值。
  • 血液储存在 2-8°C，在收到后的一周内尽快使用。 
  • 将测试样品添加到血液中并取初始等分试样。 强化血液如指示在 37°C 下孵育。 孵育后，取出等分试样进行分析。 将剩余的血液离心以获得血浆；收集等分试样进行分析并与初始等分试样进行比较。
  • 基质稳定性： 将测试物品以单一浓度在血液中孵育在四个时间点。
  • 平衡时间： 将测试物品以单一浓度添加到血液中，在四个时间点。
  • 蛋白质结合浓度依赖性： 将测试物品以高达 5 种浓度添加到血液中并孵育至平衡时间点。
  • 对于放射性标记的测试物品，血液等分试样在液体闪烁计数（LSC）之前进行溶解处理。 对于非放射性标记的测试物品，血液等分试样在提取和使用液相色谱-质谱（LC-MS）进行分析之前进行裂解。

  • 评估测试物品在体外与人肝微粒体蛋白结合的潜力，可以在使用这些系统进行测定时校正未结合分数。
  • 使用高通量透析设备（HTDialysis LLC，Gales Ferry，CT）进行三次重复的平衡透析。在供体室中添加强化微粒体，并在每个孔的受体室中添加测定缓冲液。 然后用透气膜密封培养板，并在 37°C 下在含有 5% CO2 的环境中孵育 5 小时。 孵育后，使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析来自每个腔室的样品。
  • 蛋白质结合： 将人肝微粒体在磷酸盐缓冲液中稀释至三种浓度（0.05、0.1、0.5 mg/mL）。 然后将测试物品以三种浓度添加到微粒体中，总共 9 个样品。 将强化基质样品一式三份转移到 HTD 供体室，并用磷酸盐进行透析 5 小时。
  • 微粒体的稳定性： 将上述强化基质样品在 5% CO2 的环境中于 37°C 下孵育 0 小时和 5 小时。

 

交付物

血浆蛋白结合测定将确定测试品结合的程度，提供结合和未结合的百分比、透析平衡时间以及人类和其他选定的临床前物种的浓度依赖性特征。 血液与血浆的分配将提供分配系数。 然后，这些数据可用于计算血浆中的游离分数，以便校正体内暴露以分析功效和安全裕度。  

微粒体蛋白结合测定将确定测试物质与人肝微粒体蛋白的结合程度，以校正 IC50 或其他参数以考虑游离药物组分。