酵素誘導
薬剤の代謝品質を調査する一方で、薬剤が酵素発現を誘導または増強する場合に、併用投与された薬剤の有効な血漿濃度を達成する際の潜在的な問題を強調するために、酵素誘導研究も含める必要があります。 酵素誘導は、活性代謝産物の全身曝露の増加によって引き起こされる代謝クリアランスまたは毒性の増加をもたらす可能性があります。
CYP酵素 (通常はCYP1A2、CYP2B6、およびCYP3A4) の誘導が、ヒト肝細胞の単層培養における試験品への曝露後にin vitro測定されます。
最初の実験では、CYP1A2、CYP2B6、およびCYP3A4酵素を誘導する可能性を調査する必要があります。 CYP3A4酵素の誘導が観察された場合、スポンサーはCYP2C酵素 (CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19) の誘導の可能性も評価する必要があります。 次に、その効果を、調査中のCYP酵素のポジティブコントロール誘導剤によって誘発される効果と比較します。 さらに、ex vivo動物の肝臓(典型的にはマウス、ラット、イヌ、またはサル)を細胞分画に加工し、安全性評価試験中にin vivo投与後の薬物代謝酵素に対する試験品による効果を評価するために使用できます。
酵素誘導研究における規制上の考慮事項
これらの研究は、ファーストインヒューマン試験に進む前に、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP3A4に対するシトクロムP450誘導を評価するために、FDAとEMAの両方の薬物間相互作用 (DDI) ガイドラインによって推奨されています。
誘導データは、臨床DDI研究の要件と範囲を決定するために使用されます。
方法
- テストシステム: 個々のヒトドナー肝細胞、凍結保存
- 評価されたCYP酵素: CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5。
- 試験品濃度: 溶解度によって制限されない限り、予測される臨床曝露 (0.1 – 10X Cmax) をカバーするように選択されます。 細胞毒性については5つの濃度、mRNA誘導には7つの濃度、酵素活性誘導には3つの濃度を選択します。
- インキュベーション時間: 72時間、24時間ごとにメディアが更新されます。
細胞毒性
予備アッセイでは、1人のドナーからの肝細胞を、試験品(5濃度)またはポジティブコントロールタモキシフェン(50μM)の存在下で、37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2中で72時間培養し、試験品またはコントロールを含む培地の交換を24時間ごとに行います。 72時間後、MTSアッセイを使用して肝細胞の生存率が評価されます。 結果は、誘導アッセイの無毒試験品濃度を決定するために使用されます。
安定性
細胞毒性アッセイと併せて、培地サンプルを収集して、経時的な試験品の濃度を評価します。
CYP mRNA誘導
3人のドナー由来の肝細胞を、試験品(7濃度)または対照誘導物質(下記参照)の有無にかかわらず、37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2中で72時間インキュベートし、培地±試験品または対照の交換を24時間ごとに行う。 72時間後、mRNAを抽出し、リアルタイム定量PCRによって遺伝子発現を決定します。 各CYP mRNAのレベルは、内因性制御遺伝子(GAPDHなど)のレベルに正規化されます。 次に、CYP遺伝子発現の倍数誘導を2-ΔΔCT法を使用して計算します。 試験品依存性のCYP mRNAレベルの増加がビヒクルコントロールと比較して≥2倍、または応答≥20%のポジティブコントロールの応答は、陽性結果として解釈される場合があります。
CYP酵素誘導
3つのドナー由来の肝細胞は、試験物質（3つの濃度）または対照誘導物質（上記のように）の有無下で、37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2中で72時間、3つのウェルで培養され、培地と試験物質または対照の交換は24時間ごとに行われます。 72時間後、肝細胞を適切なCYP基質（下記参照）を含む新鮮な培地で2時間インキュベートした後、反応を停止し、LC-MS分析法を用いて代謝産物（下記参照）の分析のためにサンプルを採取します。 試験品依存性のCYP酵素活性の増加がビヒクルコントロールと比較して2倍以上、または応答がポジティブコントロールの応答の20%以上の場合は、陽性結果として解釈できます。