효소 유도
약물의 대사적 특성을 조사하는 동안, 약물이 효소 발현을 유도하거나 증가시킬 때 동시에 투여되는 약물의 효과적인 혈장 농도를 달성하는 데 잠재적인 문제점을 강조하기 위해 효소 유도 연구도 포함하고 싶을 것입니다. 효소 유도는 활성 대사산물의 전신 노출 증가로 인해 대사 클리어런스나 독성이 증가할 수 있습니다.
CYP 효소(일반적으로 CYP1A2, CYP2B6 및 CYP3A4)의 유도는 인간 간세포 단층 배양에서 시험 물질에 노출된 후 시험관 내에서 측정됩니다.
초기 실험에서는 CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4 효소를 유도하는 가능성을 조사해야 합니다. CYP3A4 효소의 유도가 관찰되면 후원자는 CYP2C 효소(CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19)의 유도 가능성도 평가해야 합니다. 그런 다음 그 효과를 조사 중인 CYP 효소의 양성 대조 유도제가 유발한 효과와 비교합니다. 또한, 엑스 비보 동물의 간(일반적으로 쥐, 쥐, 개 또는 원숭이)을 세포 소기관 분획으로 처리하여 안전성 평가 연구 중 생체 내 투여 후 약물 대사 효소에 대한 시험 항목 매개 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
효소 유도 연구에 대한 규제 고려 사항
이러한 연구는 최초 인체 시험에 들어가기 전에 CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 및 CYP3A4에 대한 시토크롬 P450 유도를 평가하기 위해 FDA와 EMA의 약물-약물 상호작용(DDI) 가이드라인에서 권장됩니다.
유도 데이터는 임상 DDI 연구의 요구 사항과 범위를 결정하는 데 사용됩니다.
방법
- 테스트 시스템: 개별 인간 기증 간세포, 냉동보관
- 평가된 CYP 효소: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
- 시험 물질 농도: 용해도에 의해 제한되지 않는 한 예상되는 임상 노출(0.1 – 10X Cmax)을 괄호로 묶기 위해 선택되었습니다. 세포독성을 위해 5가지 농도, mRNA 유도를 위해 7가지 농도, 효소 활성 유도를 위해 3가지 농도를 선택합니다.
- 배양 시간: 72시간 동안 미디어를 24시간마다 교체합니다.
세포독성
예비 분석에서, 한 기증자의 간세포를 시험 물질(5가지 농도) 또는 양성 대조군 타목시펜(50 µM)이 존재하는 3개의 배양 용기에 담아 습윤 배양기에서 37°C, 5% CO2로 72시간 동안 배양합니다. 이때 배지 ± 시험 물질 또는 대조군을 24시간마다 교환합니다. 72시간 후, MTS 분석을 사용하여 간세포의 생존력을 평가합니다. 결과는 유도 검정을 위한 무독성 시험 물질 농도를 결정하는 데 사용됩니다.
안정
세포독성 분석과 함께, 시간 경과에 따른 시험 물질의 농도를 평가하기 위해 배지 샘플을 수집합니다.
CYP mRNA 유도
3명의 기증자로부터 채취한 간세포를 시험 물질(7가지 농도) 또는 대조군 유도물질(아래 참조)이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 37°C, 5% CO2의 습도 조절 인큐베이터에서 72시간 동안 3개의 웰에 나누어 배양합니다. 이때 배지 ± 시험 물질 또는 대조군을 24시간마다 교환합니다. 72시간 후 mRNA를 추출하고 실시간 정량 PCR을 통해 유전자 발현을 확인합니다. 각 CYP mRNA 수준은 내인성 제어 유전자(예: GAPDH)의 수준과 동일하게 정규화됩니다. CYP 유전자 발현의 유도 배수는 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산됩니다. CYP mRNA 수치가 대조군 대비 시험 물질에 따라 ≥2배 증가하거나 양성 대조군 반응의 ≥20%에 해당하는 반응은 양성 결과로 해석될 수 있습니다.
CYP 효소 유도
3명의 기증자로부터 채취한 간세포를 습도가 높은 인큐베이터에서 37°C, 5% CO2로 72시간 동안 시험 물질(3가지 농도) 또는 대조 유도 물질(위와 같음)이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 3개의 웰에 나누어 배양하고, 배지 ± 시험 물질 또는 대조 물질을 24시간마다 교환합니다. 72시간 후, 간세포를 적절한 CYP 기질(아래 참조)이 포함된 신선한 배지에서 2시간 동안 배양한 후 반응을 종료하고 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 대사산물(아래 참조)을 분석하기 위해 샘플을 수집합니다. CYP 효소 활성이 대조군에 비해 시험 물질에 따라 ≥2배 증가하거나 양성 대조군 반응의 ≥20%에 해당하는 반응은 양성 결과로 해석될 수 있습니다.