酶诱导
在研究药物的代谢品质时，您还需要包括酶诱导研究，以突出当您的药物诱导或增强酶表达时，在同时给药药物中实现有效血浆浓度的潜在问题。 酶诱导可导致代谢清除率增加或毒性增加，这是由于活性代谢物的全身暴露增加而引起的。
在人肝细胞单层培养物中暴露于测试物品后，在体外 测量 CYP 酶（通常为 CYP1A2、CYP2B6 和 CYP3A4）的诱导。
初始实验应研究诱导 CYP1A2、CYP2B6 和 CYP3A4 酶的潜力。 如果观察到 CYP3A4 酶的诱导，申办者还应评估 CYP2C 酶（CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19）的诱导潜力。 然后将这些效果与所研究的 CYP 酶的阳性对照诱导剂引起的效果进行比较。 此外，离体动物肝脏（通常是小鼠、大鼠、狗或猴子）可以加工成亚细胞组分，并用于在安全性评估研究期间评估测试物品介导的体内给药后对药物代谢酶的影响。
酶诱导研究的监管注意事项
FDA 和 EMA 药物相互作用（DDI）指南都推荐这些研究，以评估细胞色素 P450 诱导 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP3A4，然后再进行首次人体试验。
诱导数据用于确定临床 DDI 研究的要求和范围。
方法
- 测试系统： 个体人类供体肝细胞，冷冻保存
- 评估的 CYP 酶： CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5。
- 测试品浓度： 选择的范围为预测的临床暴露（0.1–10X Cmax），除非受溶解度限制。 选择 5 种浓度用于细胞毒性，7 种浓度用于 mRNA 诱导，3 种浓度用于酶活性诱导。
- 孵育时间： 72 小时，每 24 小时刷新一次培养基。
细胞毒性
在初步测定中，将来自一个供体的肝细胞在供试品（五种浓度）或阳性对照他莫昔芬（50μM）存在下，在 37°C 的加湿培养箱中在 5%CO2 中的三重复孔中培养 72 小时，每 24 小时更换培养基和/或试品或对照。 72 小时后，将使用 MTS 测定评估肝细胞的活力。 结果将用于确定诱导测定的无毒供试品浓度。
稳定性
结合细胞毒性测定，收集培养基样品以评估测试物品随时间变化的浓度。
CYP mRNA 诱导
将来自三个供体的肝细胞在存在或不存在测试物品（七种浓度）或对照诱导剂（见下文）的情况下，在三份孔中孵育 72 小时，在 37°C 的加湿培养箱中，在 5% CO2 中，每 24 小时交换一次培养基，有或没有测试物品或对照。 72 小时后，提取 mRNA，通过实时荧光定量 PCR 测定基因表达。 每个 CYP mRNA 的水平被标准化为内源性对照基因（例如 GAPDH）的水平。 然后使用 2-ΔΔCT 方法计算 CYP 基因表达的倍数诱导。 CYP mRNA 水平相对于载体对照增加 ≥2 倍，或反应≥阳性对照反应的 20%），可解释为阳性结果。
CYP 酶诱导
来自三个供体的肝细胞在存在或不存在测试物品（三种浓度）或对照诱导剂（如上）的情况下在三重复孔中生长 72 小时，在 37°C 的加湿培养箱中，在 5%的 CO2 中，每 24 小时进行培养基和测试物品或对照的交换。 72 小时后，将肝细胞在含有适当 CYP 底物（见下文）的新鲜培养基中孵育 2 小时，然后终止反应并收集样品以使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析方法分析代谢物（见下文）。 测试物品导致的 CYP 酶活性相对于载体对照增加≥2 倍，或反应达到阳性对照反应的≥20%，可以解释为阳性结果。