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Liaison aux protéines

Après l’entrée et l’apparition d’un médicament dans la circulation systémique, seule la fraction libre et la fraction non liée sont capables d’un effet pharmacologique (ou toxicologique). L’étendue de la liaison aux protéines plasmatiques peut être déterminée in vitro ou ex vivo par dialyse à l’équilibre ; ultrafiltration ou ultracentrifugation.

  • Conformité réglementaire

  • Des méthodes diverses

  • Analyse de l’efficacité et de l’innocuité

La séparation d'un échantillon testé en érythrocytes et plasma peut être déterminée in vitro ou ex vivo dans du sang animal ou humain. La liaison aux protéines microsomiques peut être évaluée par dialyse d’équilibre. Des données décrivant la façon dont le médicament se lie aux protéines plasmatiques et le fonctionnement de la répartition sang-plasma sont nécessaires pour aider à l’évaluation des données pharmacologiques, pharmacocinétiques et toxicologiques. (Voir aussi SEND 3.1)

Considérations réglementaires pour les études de liaison aux protéines plasmatiques, de partage du sang au plasma et de liaison aux protéines microsomiques

L’étude de la fraction non liée de la protéine plasmatique ou microsomale d’un article d’essai est essentielle pour caractériser le profil pharmacocinétique in vivo de la dose, de l’exposition, de l’efficacité et des marges de sécurité en pharmacologie clinique. L’évaluation interspécifique de la liaison aux protéines plasmatiques est une exigence de l’IND et est détaillée dans la ligne directrice M3(R2) de l’ICH.

Méthodes

  • Système d’essai : Du plasma mélangé de chaque espèce ou des solutions spécifiques de protéines plasmatiques (p. ex., albumine sérique humaine, glycoprotéine α1-acide, gammaglobuline)
  • Les concentrations sont choisies pour encadrer les expositions cliniques connues (0,1 à 10 fois Cmax), à moins qu’elles ne soient limitées par la solubilité.
  • Dialyse d’équilibre
  • La dialyse d’équilibre est réalisée à l’aide d’un appareil de dialyse à haut débit (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Une matrice fortifiée (plasma ou protéine plasmatique isolée) est ajoutée à la chambre donneuse, tandis que la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) est ajoutée à la chambre réceptrice de chaque puits. Les plaques sont ensuite scellées à l’aide d’une membrane perméable aux gaz et incubées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant la durée désignée (voir ci-dessous). Après l’incubation, les échantillons de chaque chambre sont analysés à l’aide de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS).
  • Stabilité dans la matrice : L’article d’essai est incubé dans du plasma et dans du DPBS à une concentration unique à cinq moments différents.
  • Temps d’équilibre : L’article d’essai est ajouté au plasma à une concentration unique et dialysé dans le DPBS jusqu'à cinq moments.
  • Dépendance de la concentration de liaison aux protéines : L’article d’essai est ajouté au plasma à trois concentrations et dialysé dans le DPBS pendant le temps nécessaire à l’équilibre. 
  • Un témoin positif tel que la warfarine est testé en dialyse d’équilibre parallèle pendant ≥5 heures.
  • Ultrafiltration
  • Du plasma enrichi sera ajouté au réservoir d'échantillon d’un dispositif d’ultrafiltration avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 30 000 Da. Les échantillons seront centrifugés à 37 °C et à 2 000 × g pendant 15 minutes (ou dans d’autres conditions appropriées). Après centrifugation, l’ultrafiltrat sera analysé par LC-MS pour déterminer la substance d'essai et comparer le contenu aux concentrations initiales. Toutes les déterminations de liaison aux protéines seront effectuées en trois exemplaires. 
  • Liaison non spécifique : La substance d'essai est ajoutée à l’ultrafiltrat plasmatique de contrôle (PUF) à deux concentrations et centrifugée selon la procédure d’ultrafiltration. Le dialysat sera analysé pour déterminer la récupération de la substance d'essai et la liaison non spécifique potentielle en l’absence de plasma.
  • Dépendance de la concentration de liaison aux protéines : L’article testé est ajouté au plasma à cinq concentrations et centrifugé selon la procédure d’ultrafiltration. L’ultrafiltrat sera analysé pour l’article testé.
  • Ultracentrifugation
  • Du plasma enrichi sera ajouté aux tubes d’ultracentrifugation et centrifugé à 37 °C à 223 000 × g pendant 4 heures (ou dans d’autres conditions appropriées) pour séparer l’ultracentrifugat plasmatique de la protéine plasmatique. Après centrifugation, l’ultracentrifugat sera analysée par LC-MS et comparé aux concentrations initiales. 
  • Liaison non spécifique : L’article d’essai est ajouté au plasma humain de contrôle et à l’ultrafiltrat de plasma (PUF) à deux concentrations et incubé dans des tubes d’ultracentrifugation pendant 4 heures. La matrice sera analysée pour déterminer la récupération de l’article testé et la liaison non spécifique potentielle en l’absence de plasma.
  • Dépendance de la concentration de liaison aux protéines : L’article d’essai est ajouté au plasma à cinq concentrations et centrifugé selon la procédure d’ultracentrifugation. L’ultracentrifugat sera analysé pour l’article d’essai.

  • Les études BPP sont utilisées pour déterminer la répartition sang-plasma in vitro d’un article testé dans le sang de diverses espèces, y compris l’homme.
  • Système d’essai : Le sang obtenu de chaque espèce animale peut provenir d’au moins trois donneurs. Le sang humain prélevé sur au moins trois volontaires ne sera pas regroupé.
  • Les valeurs d’hématocrite sont déterminées pour les échantillons de sang animal regroupés et les échantillons de sang humain individuels.
  • Le sang est stocké à une température de 2 à 8 °C et utilisé dès que possible dans la semaine suivant sa réception. 
  • L’article d’essai est ajouté au sang et les premières aliquotes sont prélevées. Le sang enrichi est incubé à 37 °C comme indiqué. Après l’incubation, les aliquotes sont prélevées pour analyse. Le sang restant est centrifugé pour obtenir du plasma ; les aliquotes sont collectées pour l’analyse et comparées aux aliquotes initiales.
  • Stabilité dans la matrice : L’article testé est incubé dans le sang à une concentration unique pendant un maximum de quatre points temporels.
  • Temps d’équilibre : L’article testé est ajouté au sang à une concentration unique pendant un maximum de quatre points temporels.
  • Dépendance de la concentration de liaison aux protéines : L’article testé est ajouté au sang à jusqu’à 5 concentrations et incubé jusqu’au point d'équilibre.
  • Pour les articles d’essai radiomarqués, les aliquotes sanguines sont solubilisées avant le comptage par scintillation liquide (LSC). Pour les articles d’essai non radiomarqués, les aliquotes sanguines sont lysées avant l’extraction et l’analyse à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS).

  • Une évaluation du potentiel de liaison d’un article d’essai à une protéine microsomale du foie humain in vitro permet de corriger la fraction non liée dans les essais utilisant ces systèmes.
  • La dialyse d’équilibre est réalisée en trois exemplaires à l’aide d’un appareil de dialyse à haut débit (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Des microsomes enrichis sont ajoutés à la chambre donneuse tandis qu’un tampon d’analyse est ajouté à la chambre réceptrice de chaque puits. Les plaques sont ensuite scellées à l’aide d’une membrane perméable aux gaz et incubées à 37 °C dans 5 % de CO2  pendant 5 heures. Après l’incubation, les échantillons de chaque chambre sont analysés à l’aide de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS).
  • Liaison protéique : Les microsomes hépatiques humains sont dilués à trois concentrations (0,05, 0,1, 0,5 mg/mL) dans un tampon de phosphate. L’article testé est ensuite ajouté aux microsomes à trois concentrations pour un total de 9 échantillons. Les échantillons de matrice fortifiée sont transférés en trois exemplaires dans des chambres donneuses de HTD et dialysés contre le phosphate pendant 5 heures.
  • Stabilité dans les microsomes : Les échantillons de matrice fortifiée ci-dessus sont incubés à 37 °C dans 5 % de CO2  pendant 0 et 5 heures.

 

Livrables

Les tests de liaison aux protéines plasmatiques identifieront l’étendue de la liaison de l’article testé, en fournissant un pourcentage lié et non lié, le temps nécessaire à l’équilibre de la dialyse et le profil de dépendance de la concentration chez l’homme et d’autres espèces précliniques sélectionnées. La répartition sang-plasma fournira un coefficient de partition. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour calculer la fraction libre dans le plasma afin de permettre la correction des expositions in vivo pour profiler les marges d'efficacité et de sécurité.  

Les tests de liaison aux protéines microsomales détermineront l’étendue de la liaison de l’article testé aux protéines microsomales du foie humain pour la correction de la CI50 ou d’autres paramètres pour tenir compte de la fraction libre du médicament.