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Inhibition enzymatique

L’inhibition des enzymes du cytochrome P450 (CYP) et de l’UGT est une cause majeure d’interactions médicamenteuses cliniquement pertinentes. Le potentiel inhibiteur d’un article d’essai est évalué en déterminant son effet sur le métabolisme des substrats de sonde sélective pour les enzymes CYP humaines dans des incubations groupées à base de microsomes hépatiques humains. La cinétique enzymatique inhibitrice peut être caractérisée davantage et les données résultantes utilisées pour prédire si une interaction médicamenteuse cliniquement significative peut se produire après l’administration du médicament.

  • Études recommandées par la FDA et l’EMA

  • Tests de cytotoxicité et de stabilité

  • ARNm du CYP et induction enzymatique

Considérations réglementaires pour les études d’inhibition enzymatique

Ces études sont recommandées par les directives de la FDA et de l’EMA sur les interactions médicamenteuses (DDI) pour générer des données sur l’inhibition réversible (directe) et irréversible (dépendante du temps) du cytochrome P450 avant de passer aux premiers essais chez l’homme. Les données d’inhibition sont utilisées pour déterminer la nécessité et la portée des études cliniques DDI.

Méthode

  • Système d’essai : Microsomes hépatiques humains regroupés (HLM)
  • Enzymes CYP évaluées : CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 et CYP3A4/5
  • Enzymes UGT évaluées dans des tests d’inhibition directe sur demande : UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15 
  • Concentrations de la substance d'essai : 8 concentrations en triple exemplaire
  • Toutes les préparations et incubations d’échantillons sont effectuées à l’aide d’un système automatisé de manipulation de liquides Hamilton Microlab Star

 

L’inhibition du CYP est mesurée à la fois dans des essais directs et dépendants. Un substrat sélectif du CYP est utilisé, à une concentration de substrat qui atteint la moitié de la vitesse de réaction maximale (Km) pour chaque enzyme CYP (voir ci-dessous). Les inhibiteurs connus sont utilisés comme témoins positifs pour les tests d’inhibition directe et dépendante du métabolisme. Toutes les incubations sont terminées par l’ajout d’acétonitrile réfrigéré, contenant un étalon de métabolite interne étiqueté stable spécifique au substrat du CYP.

Inhibition dépendante du temps (irréversible)

Les dosages utilisant 8 concentrations de l’article d’essai sont incubés en l’absence et en présence de NADPH pendant 30 minutes avant d’être dilutés dans un mélange de substrat pour essai. Si une inhibition notable dépendante du temps est observée, des paramètres cinétiques supplémentaires peuvent être déterminés, notamment la constante d’inactivation (kinact) et la constante d’inhibition (KI). Ces paramètres, déterminés expérimentalement en faisant varier le temps de pré-incubation et la concentration de l’inhibiteur, peuvent aider à définir le potentiel d’interactions médicamenteuses. 

Inhibition directe

Des essais sont effectués en l’absence et en présence de 8 concentrations du composé de test afin de déterminer le potentiel d’inhibition et de définir une IC50 lorsque cela est possible.

L’inhibition directe peut être caractérisée en déterminant la constante d’inhibition (Ki) et le type d’inhibition observé, à l’aide de 5 concentrations de substrat de référence.

Cytochrome P450SubstratAnalyteInhibition directeInhibition dépendante du temps
CYP1A2PhénacétineAcétaminophèneFluvoxamineFurafylline
CYP2B6BupropionHydroxybupropionOrphenadrineThioTEPA
CYP2C8L’amodiaquineDéséthylamodiaquineMontelukastGemfibrozil 1-O-β-glucuronide
CYP2C9Diclofénac4'-hydroxydiclofénacSulfaphénazoleAcide tiénilique
CYP2C19Méphénytoïne4'-hydroxyméphénytoïneNootkatoneÉsoméprazole
CYP2D6DextrométhorphaneDextrorphaneQuinidineParoxétine
CYP3A4/5Testostérone6β-hydroxytestostéroneKétoconazoleÉrythromycine
CYP3A4/5Midazolam1'-hydroxymidazolamKétoconazoleTroleandomycin

 

Livrables

Ces tests fourniront des valeurs CI50 pour l’inhibition directe ou irréversible des enzymes CYP. Si une inhibition directe significative est observée, la constante d’inhibition (Ki) peut être déterminée. Si une inhibition significative dépendante du temps est observée, les paramètres d’inactivation basés sur le mécanisme (KI et kinact) peuvent être déterminés. Compte tenu de ces paramètres, la pharmacométrie peut fournir des indications supplémentaires lors de l’évaluation de la nécessité d’un essai clinique.