L’induction des enzymes CYP (généralement CYP1A2, CYP2B6 et CYP3A4) est mesurée in vitro après exposition à l’article d’essai dans des cultures monocouches d’hépatocytes humains.
Les expériences initiales devraient étudier le potentiel d’induction des enzymes CYP1A2, CYP2B6 et CYP3A4. Si l’induction des enzymes CYP3A4 est observée, le promoteur doit également évaluer le potentiel d’induction des enzymes CYP2C (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19). Les effets sont ensuite comparés à ceux provoqués par les inducteurs de contrôle positif des enzymes CYP étudiées. De plus, les foies d’animaux ex vivo (généralement de souris, de rat, de chien ou de singe) peuvent être transformés en fractions subcellulaires et utilisés pour évaluer les effets médiés par l’article de test sur les enzymes métabolisantes des médicaments après l’administration in vivo au cours d’études d’évaluation de l’innocuité.
Considérations réglementaires pour les études d’induction enzymatique
Ces études sont recommandées par les directives de la FDA et de l’EMA sur les interactions médicamenteuses (DDI) pour évaluer l’induction du cytochrome P450 pour le CYP1A2, le CYP2B6, le CYP2C8, le CYP2C9, le CYP2C19 et le CYP3A4 avant de passer aux premiers essais chez l’homme.
Les données d’induction sont utilisées pour déterminer la nécessité et la portée des études cliniques DDI.
Méthode
- Système d’essai : Hépatocytes de donneurs humains, cryoconservés
- Enzymes CYP évaluées : CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
- Concentrations de la substance d'essai : Sélectionné pour encadrer les expositions cliniques prévues (0,1 à 10 fois Cmax), à moins d'être limité par la solubilité. Sélectionnez 5 concentrations pour la cytotoxicité, 7 pour l’induction de l’ARNm et 3 pour l’induction de l’activité enzymatique
- Temps d’incubation : 72 heures, avec des milieux renouvelés toutes les 24 heures.
Cytotoxicité
Dans les essais préliminaires, les hépatocytes d’un donneur sont cultivés en présence d’un composé à tester (cinq concentrations) ou de tamoxifène comme témoin positif (50 μM) dans des puits en triplicat pendant 72 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2, avec des échanges de milieu avec ou sans composé à tester ou témoins toutes les 24 heures. Après 72 heures, la viabilité des hépatocytes sera évaluée à l’aide du test MTS. Les résultats seront utilisés pour déterminer les concentrations d’articles d’essai non toxiques pour les essais d’induction.
Stabilité
Parallèlement à l’essai de cytotoxicité, des échantillons de milieu sont prélevés pour évaluer les concentrations de l’article d’essai au fil du temps.
Induction de l’ARNm du CYP
Les hépatocytes de trois donneurs sont incubés en présence ou en l’absence d’article d’essai (sept concentrations) ou d’inducteurs témoins (voir ci-dessous) dans des puits en triplicat pendant 72 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2, avec un échange de milieu avec ou sans article d’essai ou témoins toutes les 24 heures. Après 72 heures, l’ARNm est extrait et l’expression des gènes est déterminée par PCR quantitative en temps réel. Le niveau de chaque ARNm du CYP est normalisé à celui d’un gène de contrôle endogène (p. ex., GAPDH). L'induction de l'expression du gène CYP est ensuite calculée à l’aide de la méthode 2-ΔΔCT. L’augmentation des niveaux d’ARNm du CYP ≥2 fois dépendante de la substance d'essai par rapport au témoin véhicule, ou une réponse ≥20 % de celle des témoins positifs, peut être interprétée comme un résultat positif.
Induction de l’enzyme CYP
Les hépatocytes de trois donneurs sont cultivés en présence ou en l’absence de substance d'essai (trois concentrations) ou d’inducteurs de contrôle (comme ci-dessus) dans des puits en triplicat pendant 72 heures dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2, avec des échanges de milieu avec ou sans substance d'essai ou témoins toutes les 24 heures. Après 72 heures, les hépatocytes sont incubés dans un milieu frais contenant des substrats CYP appropriés (voir ci-dessous) pendant 2 heures, après quoi les réactions sont interrompues et des échantillons sont prélevés pour l’analyse des métabolites (voir ci-dessous) à l’aide d’une méthode analytique de chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). L’augmentation de l’activité de l’enzyme CYP ≥2 fois dépendante de la substance d'essai par rapport au témoin véhicule, ou une réponse ≥20 % de celle des témoins positifs, peut être interprétée comme un résultat positif.
