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Interactions médicamenteuses et transporteurs

Les transporteurs membranaires de médicaments, situés dans de nombreux tissus barrières du corps, peuvent interagir avec les médicaments pour affecter l’absorption, la distribution et l’élimination in vivo, et sont à l’origine d’interactions médicamenteuses cliniquement pertinentes (DDI). L’identification de l’article d’essai en tant que substrat ou inhibiteur de transporteurs peut expliquer des expositions modifiées et des toxicités cliniquement pertinentes de médicaments administrés de manière concomitante. La perméabilité intestinale d’un médicament est un facteur important de la fraction absorbée et peut être évaluée à l’aide du test de transport monocouche Caco-2.

Considérations réglementaires pour les interactions avec les transporteurs

Ces études sont recommandées par les directives de la FDA et de l’EMA sur les interactions médicamenteuses (DDI) pour évaluer les interactions avec les transporteurs avant de passer aux premiers essais chez l’homme. Les études sur les transporteurs mettent en évidence des problèmes potentiels liés à l’obtention de concentrations plasmatiques efficaces de médicaments administrés de manière concomitante en raison de l’impact d’un médicament sur l’absorption ou la distribution.

Plusieurs transporteurs interagissent avec des médicaments en usage clinique. Les tests recommandés sont les suivants :

  • Cassette de liaison de l’ATP (ABC) transporteurs d'efflux P-glycoprotéine (P-gp), protéine de résistance au cancer du sein (BCRP) et pompe d'exportation des sels biliaires (BSEP).
  • Transporteurs d'absorption de solutés (SLC) Transporteurs d'anions organiques (OAT) 1 et OAT3, Transporteur de cations organiques (OCT) 2, Polypeptides de transport d'anions organiques (OATP) 1B1, OATP1B3 et Extrusion de médicaments et de toxines (MATE) 1 et MATE2 K.

Méthodes d’interactions avec les transporteurs

  • Système d’essai : Lignées cellulaires transfectées exprimant un transporteur d’absorption unique (SLC) ou un contrôle vectoriel, cultivées en monocouches dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  • Tampon de dosage : HBSS avec HEPES, pH 7,4
  • Pour les transporteurs de MATE uniquement, les cellules sont prétraitées avec du NH4Cl pour introduire un gradient de pH à travers la membrane cellulaire, nécessaire à l’activité d’absorption du MATE
  • Concentrations de l’article d’essai : 2 pour les essais sur substrat, 2 pour les essais d’inhibition
  • Substrats de sonde radiomarqués spécifiques à chaque transporteur
  • Inhibiteurs de contrôle positif pour chaque transporteur

Les cellules exprimant le transporteur en culture sont préincubées avec un tampon de dosage pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2. Les cellules exprimant MATE sont traitées avec NH4CI pour créer un gradient de pH à travers la membrane cellulaire afin de faciliter l’activité d’absorption. Un substrat de test ou un article d’essai est ajouté aux puits en triplicat, et des inhibiteurs sont ajoutés le cas échéant. Les plaques sont incubées pendant un certain temps de 2 à 10 minutes selon le transporteur. Le tampon est aspiré, et les cellules sont lavées, puis lysées, collectées et analysées pour détecter la présence de l’article testé à l’aide de la LC-MS.

Évaluation du substrat : L’absorption de l’article d’essai par chaque transporteur seul ou en présence d’un inhibiteur sélectif sera comparée à l’absorption par le témoin vecteur après une incubation de 2 à 5 minutes. L’absorption d’un substrat de sonde par chaque transporteur seul ou en présence d’un inhibiteur sélectif, ainsi que par le contrôle du vecteur, sera effectuée en tant que témoin.

Évaluation de l’inhibiteur : L’absorption d’un substrat de sonde par chaque transporteur sera effectuée individuellement ou en présence d’un inhibiteur sélectif ou de l’article d’essai. L’absorption du substrat de la sonde par le contrôle du vecteur sera également effectuée en tant que contrôle. Si une inhibition est observée, la CI50 peut être déterminée.

  • Système d’essai : Cellules endothéliales intestinales humaines Caco-2, cultivées sur des plaques Transwell dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 21 à 24 jours
  • Tampon de dosage : HBSS avec HEPES, pH 7,4 dans les chambres apicales et basolatérales
  • La résistance électrique transendothéliale (TEER) est mesurée avant le test pour confirmer la formation de jonctions serrées
  • Concentrations de l’article d’essai : 2 pour les essais sur substrat, 2 pour les essais d’inhibition
  • Les marqueurs de perméabilité radiomarqués, le mannitol et la caféine, sont utilisés pour vérifier la formation de jonctions serrées.
  • Des substrats de sonde radiomarqués sont utilisés, spécifiques à chaque transporteur
  • Inhibiteurs sélectifs de contrôle positif pour chaque transporteur avec contrôles inhibiteurs négatifs

La perméabilité apparente des substrats de l’article d’essai et de sonde est déterminée dans les directions apicale à basolatérale (A-B) et basolatérale à apicale (B-A) sur des plaques transwell. Après 30 minutes de préincubation dans un tampon d’essai dans un incubateur humidifié à 37 °C dans 5 % de CO2, la sonde ou l’article d’essai est ajouté dans une chambre (donneur) avec un tampon vierge dans la chambre opposée (récepteur). Des inhibiteurs sont ensuite ajoutés aux deux chambres, le cas échéant. Les plaques sont incubées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 2 heures. Des échantillons de la chambre donneuse et de la chambre réceptrice sont prélevés et analysés à l’aide de la LC-MS pour détecter la présence de l’article d’essai. Ensuite, la perméabilité de l’article d’essai et le rapport d’efflux sont déterminés.

Évaluation du substrat : Le transport de l’article d’essai seul ou en présence d’inhibiteurs sélectifs sera déterminé dans les deux sens. Le transport d’un substrat de sonde pour chaque transporteur seul ou en présence d’inhibiteurs sélectifs sera effectué à titre de témoins.

Évaluation de l’inhibiteur : Le transport d’un substrat de sonde sera déterminé dans les deux sens après une incubation de 2 heures seul ou en présence d’un inhibiteur sélectif ou de l’article d’essai. Si l’on observe une inhibition du transport de l’efflux, la CI50 peut être déterminée.

  • Système d’essai : Vésicules membranaires (50 μg/puits) exprimant le transporteur d’efflux (ABC) BSEP.
  • Concentrations de l’article d’essai : 2 pour les dosages de substrat ; 2 pour les dosages d’inhibition.
  • L’activité dépendante de l’adénosine triphosphate (ATP) est mesurée, avec l’adénosine monophosphate (AMP) utilisée comme témoin.
  • Substrat de sonde radiomarquée spécifique pour BSEP
  • Inhibiteurs de contrôle positif pour chaque transporteur

Les vésicules membranaires exprimant la BSEP et l’article d’essai ou le substrat de la sonde seront incubés dans des plaques à 96 puits. L’absorption sera amorcée par l’ajout d’adénosine triphosphate (ATP), suivie d’une incubation de 30 minutes à 37 °C. L’adénosine monophosphate (AMP) sera utilisée en parallèle comme contrôle négatif. L’absorption sera terminée par une aspiration sous vide et un rinçage des filtres deux fois avec un excès de tampon de transport glacé. Les vésicules sont ensuite extraites des plaques filtrantes pour la quantification par LC-MS et le calcul de l’activité dépendante de l’ATP.

Évaluation du substrat : L’absorption de l’article testé seul et avec un inhibiteur sélectif en présence d’ATP sera comparée à l’absorption en présence d’AMP.  L’absorption d’un substrat de sonde par le BSEP seul et en présence d’un inhibiteur sélectif sera effectuée comme témoins.

Évaluation de l’inhibiteur : L’absorption d’un substrat de sonde sera effectuée seule et en présence d’un inhibiteur sélectif ou de l’article d’essai ; l’absorption en présence d’ATP sera comparée à l’absorption en présence d’AMP.  Si l’on observe une inhibition de l’absorption de l’article d’essai dépendante de l’ATP, la CI50 peut être déterminée.

 

Livrables

Ces tests permettront d’identifier et de profiler les interactions de substrat ou d’inhibition avec les transporteurs de médicaments membranaires. Les données décriront l’étendue de l’absorption et/ou de l’efflux, la perméabilité de l’article d’essai, l’inhibition du transporteur et les valeurs de la CI50 , le cas échéant.

Ces données peuvent également être utilisées pour évaluer les risques de DDI en fonction des interactions probables avec des traitements concomitants et aider à classer les nouveaux candidats médicaments. Si des interactions sont observées, la pharmacométrie peut fournir des indications supplémentaires lors de l’évaluation de la nécessité d’un essai clinique.