Zum Hauptinhalt wechseln

Proteinbindung

Nach dem Eintritt eines Arzneimittels in den systemischen Kreislauf kann nur die freie und ungebundene Fraktion pharmakologisch (oder toxikologisch) wirken. Das Ausmaß der Plasmaproteinbindung kann in vitro oder ex vivo durch Gleichgewichtsdialyse, Ultrafiltration oder Ultrazentrifugation bestimmt werden.

  • Regulatorische Einhaltung

  • Vielfältige Methoden

  • Analyse auf Wirksamkeit und Sicherheit

Die Verteilung einer Testsubstanz in Erythrozyten vs. Plasma kann in vitro oder ex vivo im tierischen und menschlichen Blut bestimmt werden. Die mikrosomale Proteinbindung kann durch Gleichgewichtsdialyse ausgewertet werden. Daten, die beschreiben, wie das Medikament an Plasmaproteine bindet und wie die Blut-zu-Plasma-Verteilung funktioniert, sind erforderlich, um bei der Bewertung pharmakologischer, pharmakokinetischer und toxikologischer Daten zu helfen. (Siehe auch SEND 3.1) 

Regulatorische Überlegungen für die Plasmaproteinbindung, die Blut-Plasma-Partitionierung und mikrosomale Proteinbindungsstudien

Die Untersuchung der ungebundenen Fraktion des Plasmas oder des mikrosomalen Proteins eines Testartikels ist entscheidend für die Charakterisierung des pharmakokinetischen In-vivo-Profils von Dosis, Exposition, Wirksamkeit und Sicherheitsmargen in der klinischen Pharmakologie. Die speziesübergreifende Bewertung der Plasmaproteinbindung ist eine IND-Anforderung und wird in der ICH M3(R2)-Anleitung ausführlich beschrieben.

Methoden

  • Prüfsystem: Gepooltes Plasma von jeder Spezies oder spezifische Plasmaproteinlösungen (z. B. humanes Serumalbumin, α1-Säure-Glykoprotein, Gammaglobulin)
  • Die Konzentrationen werden so gewählt, dass sie bekannte klinische Expositionen (0,1 – 10X Cmax) umfassen, sofern sie nicht durch die Löslichkeit begrenzt sind.
  • Gleichgewichtsdialyse
  • Die Gleichgewichtsdialyse wird mit einem Hochdurchsatz-Dialysegerät (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT) durchgeführt. Eine angereicherte Matrix (entweder Plasma oder isoliertes Plasmaprotein) wird in die Donorkammer gegeben, während Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in die Empfängerkammer jeder Vertiefung gegeben wird. Die Platten werden dann mit einer gasdurchlässigen Membran verschlossen und bei 37 °C in 5 % CO2 für die angegebene Zeit inkubiert (siehe unten). Nach der Inkubation werden die Proben aus jeder Kammer mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert.
  • Stabilität in der Matrix: Der Prüfling wird im Plasma und in DPBS in einer einzigen Konzentration an bis zu fünf Zeitpunkten inkubiert.
  • Zeit bis zum Gleichgewicht: Der Prüfling wird in einer einzigen Konzentration in das Plasma gegeben und bis zu fünf Zeitpunkte lang gegen DPBS dialysiert.
  • Konzentrationsabhängigkeit der Proteinbindung: Der Prüfling wird in drei Konzentrationen in das Plasma gegeben und für die für das Gleichgewicht erforderliche Zeit gegen DPBS dialysiert. 
  • Eine Positivkontrolle wie Warfarin wird ≥5 Stunden lang in einer parallelen Gleichgewichtsdialyse getestet.
  • Ultrafiltration
  • Angereichertes Plasma wird dem Probenreservoir eines Ultrafiltrationsgeräts mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 30.000 Da zugesetzt. Die Proben werden bei 37 °C und 2.000 × g für 15 Minuten (oder unter anderen geeigneten Bedingungen) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird das Ultrafiltrat mittels LC-MS auf Prüfsubstanz und Inhalt im Vergleich zu den Ausgangskonzentrationen analysiert. Alle Proteinbindungsbestimmungen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. 
  • Unspezifische Bindung: Die Testsubstanz wird zu Kontrollplasma-Ultrafiltrat (PUF) in zwei Konzentrationen zugegeben und nach dem Ultrafiltrationsverfahren zentrifugiert. Das Dialysat wird analysiert, um die Wiederfindung der Testsubstanz und eine mögliche unspezifische Bindung in Abwesenheit von Plasma zu bestimmen.
  • Konzentrationsabhängigkeit der Proteinbindung: Die Testsubstanz wird in fünf Konzentrationen in das Plasma gegeben und nach dem Ultrafiltrationsverfahren zentrifugiert. Das Ultrafiltrat wird auf die Testsubstanz analysiert.
  • Ultrazentrifugation
  • Angereichertes Plasma wird den Ultrazentrifugenröhrchen zugesetzt und 4 Stunden lang (oder unter anderen geeigneten Bedingungen) bei 37 °C bei 223.000 × g zentrifugiert, um eine Trennung des Plasma-Ultrazentrifugats vom Plasmaprotein zu erreichen. Nach der Zentrifugation wird das Ultrazentrifugat mittels LC-MS analysiert und mit den Ausgangskonzentrationen verglichen. 
  • Unspezifische Bindung: Der Testartikel wird zur Kontrolle von menschlichem Plasma und Plasmaultrafiltrat (PUF) in zwei Konzentrationen hinzugefügt und 4 Stunden lang in Ultrazentrifugenröhrchen inkubiert. Die Matrix wird analysiert, um die Wiederfindung des Testobjekts und eine mögliche unspezifische Bindung in Abwesenheit von Plasma zu bestimmen.
  • Konzentrationsabhängigkeit der Proteinbindung: Der Prüfling wird in fünf Konzentrationen in das Plasma gegeben und nach dem Ultrazentrifugationsverfahren zentrifugiert. Das Ultrazentrifugat wird auf den Testartikel hin analysiert.

  • BPP-Studien werden verwendet, um die in vitro Blut-Plasma-Partitionierung eines Testobjekts in Blut verschiedener Spezies, einschließlich des Menschen, zu bestimmen.
  • Prüfsystem: Das von jeder Tierart gewonnene Blut kann von mindestens drei Spendern zusammengelegt werden. Menschliches Blut, das von mindestens drei Freiwilligen gewonnen wurde, wird nicht zusammengelegt.
  • Die Hämatokritwerte werden für die gepoolten tierischen Blutproben und die einzelnen menschlichen Blutproben bestimmt.
  • Das Blut wird bei 2-8°C gelagert und so schnell wie möglich innerhalb von 1 Woche nach Erhalt verwendet. 
  • Der Testartikel wird dem Blut zugesetzt und es werden erste Aliquoten genommen. Angereichertes Blut wird wie angegeben bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Aliquots für die Analyse entnommen. Restliches Blut wird zentrifugiert, um Plasma zu erhalten; Aliquote werden für die Analyse gesammelt und mit den initialen Aliquoten verglichen.
  • Stabilität in der Matrix: Der Testartikel wird für bis zu vier Zeitpunkte in einer einzigen Konzentration im Blut inkubiert.
  • Zeit bis zum Gleichgewicht: Der Testartikel wird dem Blut in einer einzigen Konzentration für bis zu vier Zeitpunkte zugesetzt.
  • Konzentrationsabhängigkeit der Proteinbindung: Der Testartikel wird dem Blut in bis zu 5 Konzentrationen zugesetzt und bis zum Gleichgewichtszeitpunkt inkubiert.
  • Bei radioaktiv markierten Testartikeln werden Blutaliquote vor der Flüssigszintillationszählung (LSC) solubilisiert. Bei nicht radioaktiv markierten Testartikeln werden die Blutaliquoten vor der Extraktion und Analyse mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) lysiert.

  • Eine Bewertung des Potenzials eines Testartikels, in vitro an das mikrosomale Protein der menschlichen Leber zu binden, ermöglicht die Korrektur der ungebundenen Fraktion in Assays, die diese Systeme verwenden.
  • Die Gleichgewichtsdialyse wird in dreifacher Ausfertigung mit einem Hochdurchsatz-Dialysegerät (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT) durchgeführt. Angereicherte Mikrosomen werden in die Donorkammer gegeben, während ein Assay-Puffer in die Empfängerkammer jeder Vertiefung gegeben wird. Anschließend werden die Platten mit einer gasdurchlässigen Membran verschlossen und bei 37 °C in 5 % CO2 5 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Proben aus jeder Kammer mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert.
  • Proteinbindung: Humane Lebermikrosomen werden in Phosphatpuffer auf drei Konzentrationen (0,05, 0,1, 0,5 mg/mL) verdünnt. Das Testobjekt wird dann in drei Konzentrationen zu Mikrosomen gegeben, also insgesamt 9 Proben. Angereicherte Matrixproben werden in dreifacher Ausfertigung in HTD-Donorkammern überführt und 5 Stunden lang gegen Phosphat dialysiert.
  • Stabilität in Mikrosomen: Angereicherte Matrixproben von oben werden bei 37 °C in 5 % CO2  für 0 und 5 Stunden inkubiert.

 

Lieferumfang

Plasmaprotein-Bindungsassays identifizieren das Ausmaß der Bindung an die Testsubstanz und liefern einen gebundenen und ungebundenen Prozentsatz, die Zeit bis zum Dialysegleichgewicht und das Konzentrationsabhängigkeitsprofil beim Menschen und anderen ausgewählten präklinischen Spezies. Die Blut-Plasma-Partitionierung liefert einen Verteilungskoeffizienten. Diese Daten können dann zur Berechnung der freien Fraktion im Plasma verwendet werden, um eine Korrektur der In-vivo-Expositionen zu ermöglichen, um die Wirksamkeits- und Sicherheitsmargen zu bestimmen.  

Mikrosomale Proteinbindungsassays identifizieren das Ausmaß der Bindung der Testsubstanz an menschliche mikrosomale Leberproteine, um IC50 oder andere Parameter zur Berücksichtigung der freien Wirkstofffraktion zu korrigieren.