Regulatorische Wirksamkeit für weitere Studien
Plasma-, Hepatozyten- und Mikrosomentests
Umfassende Bewertung der Arzneimittelstabilität
Diese Studien werden verwendet, um die Halbwertszeit von Verbindungen zu messen, die intrinsische Clearance zu berechnen und pharmakokinetische Profile beim Menschen im Vorfeld von First-in-Human-Studien vorherzusagen.
Methode zur metabolischen Stabilität
Metabolische Stabilität in Hepatozyten
Der Testartikel wird in zwei Konzentrationen mit ca. 1 x 106 Hepatozyten/ml, die in William's Medium E suspendiert sind, für bis zu 5 Zeitpunkte inkubiert und durch Zugabe von organischem Lösungsmittel gestoppt.
Kontrollinkubationen werden nur im Inkubationsmedium durchgeführt, um die Stabilität des Prüflings unter Inkubationsbedingungen zu bestimmen. Die metabolische Integrität jeder Hepatozytencharge wird mit 7-Ethoxycumarin oder einem anderen geeigneten Marker bewertet.
Metabolische Stabilität im Plasma
Der Prüfling wird bei zwei Konzentrationen im Plasma für bis zu 5 Zeitpunkte inkubiert und durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels gestoppt. Positivkontroll-Inkubationen umfassen Procain (hydrolysiert durch Carboxylesterase) oder andere geeignete metabolische Marker.
Metabolische Stabilität in Mikrosomen
Die Testsubstanz wird in zwei Konzentrationen mit Mikrosomen (0,5 mg/ml Protein) in Gegenwart von NADPH für bis zu 5 Zeitintervalle inkubiert und durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels gestoppt. Kontrollinkubationen werden in Abwesenheit von NADPH durchgeführt, um die Stabilität des Prüflings unter Inkubationsbedingungen zu bestimmen.
Die metabolische Integrität jeder Mikrosomencharge wird auf Phase-1-Enzyme unter Verwendung von 7-Ethoxycumarin oder einem anderen geeigneten Marker bewertet.
Probenanalyse
Die Inkubationsproben werden mit einer Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Analysemethode auf den verbleibenden Testartikel analysiert. Anschließend wird der prozentuale Anteil des verbleibenden Testartikels in den Proben im Vergleich zur Ausgangskonzentration bestimmt. Nach der Zulassung können ausgewählte Proben weiter analysiert werden, um Metaboliten mittels LC-MS zu charakterisieren oder zu identifizieren.
Diese Assays liefern Informationen zur Wirkstoffstabilität (berechnet bei der Halbwertszeit und der intrinsischen Clearance) unter Verwendung zellulärer oder subzellulärer Fraktionen. Eine weitere Analyse von Inkubationen zur Erstellung und Identifizierung von Metaboliten kann die Biotransformationswege aufklären und einen besseren Vergleich zwischen präklinischen Testspezies und menschlichen Metaboliten ermöglichen.
