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Hemmung von Enzymen

Die Hemmung von Cytochrom P450 (CYP) und UGT-Enzymen ist eine der Hauptursachen für klinisch relevante Arzneimittelwechselwirkungen. Das inhibitorische Potenzial eines Prüflings wird bewertet, indem seine Wirkung auf den Metabolismus selektiver Sondensubstrate für humane CYP-Enzyme in gepoolten humanen hepatischen Mikrosomen-basierten Inkubationen bestimmt wird. Die inhibitorische Enzymkinetik kann weiter charakterisiert und die resultierenden Daten verwendet werden, um vorherzusagen, ob nach der Verabreichung des Arzneimittels eine klinisch signifikante Arzneimittelwechselwirkung auftreten kann.

  • Von der FDA und der EMA empfohlene Studien

  • Zytotoxizitäts- und Stabilitätsassays

  • CYP mRNA und Enzyminduktion

Regulatorische Überlegungen für Studien zur Enzymhemmung

Diese Studien werden sowohl von der FDA als auch von der EMA für Arzneimittelwechselwirkungen (DDI) empfohlen, um Daten sowohl zur reversiblen (direkten) als auch zur irreversiblen (zeitabhängigen) Hemmung von Cytochrom P450 zu generieren, bevor First-in-Human-Studien durchgeführt werden. Inhibitionsdaten werden verwendet, um die Anforderung und den Umfang klinischer DDI-Studien zu bestimmen.

Methode

  • Prüfsystem: Gepoolte humane Lebermikrosomen (HLM)
  • CYP-Enzyme untersucht: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 und CYP3A4/5
  • UGT-Enzyme, die auf Anfrage in direkten Inhibitionsassays bewertet werden: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT11A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15 
  • Konzentrationen von Testsubstanzen: 8 Konzentrationen in dreifacher Ausführung
  • Alle Probenvorbereitungen und Inkubationen werden mit einem automatisierten Liquid-Handling-System von Hamilton Microlab Star durchgeführt

 

Die CYP-Hemmung wird sowohl in direkten als auch in abhängigen Assays gemessen. Es wird ein CYP-selektives Substrat in einer Substratkonzentration verwendet, die die Hälfte der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) für jedes CYP-Enzym erreicht (siehe unten). Bekannte Inhibitoren werden als Positivkontrollen sowohl für direkte als auch für stoffwechselabhängige Inhibitionsassays verwendet. Alle Inkubationen werden durch Zugabe von gekühltem Acetonitril beendet, das einen stabil markierten internen Metabolitenstandard enthält, der für das CYP-Substrat spezifisch ist.

Zeitabhängige (irreversible) Hemmung

Assays mit 8 Konzentrationen des Testobjekts werden 30 Minuten lang in Abwesenheit und Gegenwart von NADPH inkubiert, bevor sie zu einer Sondensubstrat-Assay-Mischung verdünnt werden. Wenn eine nennenswerte zeitabhängige Hemmung beobachtet wird, können zusätzliche kinetische Parameter bestimmt werden, einschließlich der Inaktivierungskonstante (kinact) und der Inhibitionskonstante (KI). Diese Parameter, die experimentell durch Variation der Vorinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration bestimmt werden, können dazu beitragen, das Potenzial für Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln zu definieren. 

Direkte Hemmung

Die Assays werden in Abwesenheit und Gegenwart von 8 Konzentrationen des Prüflings durchgeführt, um das Inhibitionspotenzial zu bestimmen und nach Möglichkeit einen IC50 zu definieren.

Die direkte Hemmung kann weiter charakterisiert werden, indem die Hemmungskonstante (Ki) und die Art der beobachteten Hemmung unter Verwendung von 5 Konzentrationen des Sondensubstrats bestimmt werden.

Cytochrom P450SubstratAnalytDirekte HemmungZeitabhängige Hemmung
CYP1A2PhenacetinAcetaminophenFluvoxaminFurafyllin
CYP2B6BupropionHydroxybupropionOrphenadrinThioTEPA
CYP2C8AmodiaquineDesethylamodiaquineMontelukastGemfibrozil 1-O-β-Glucuronid
CYP2C9Diclofenac4'-HydroxydiclofenacSulfaphenazolTienilsäure
CYP2C19Mephenytoin4'-HydroxymephenytoinNootkatonEsomeprazol
CYP2D6DextromethorphanDextrorphanChinidinParoxetin
CYP3A4/5Testosteron6β-HydroxytestosteronKetoconazolErythromycin
CYP3A4/5Midazolam1'-HydroxymidazolamKetoconazoleTroleandomycin

 

Ergebnisse

Diese Assays liefern IC50-Werte für die direkte oder irreversible Hemmung von CYP-Enzymen. Wenn eine signifikante direkte Hemmung beobachtet wird, kann die Hemmungskonstante (Ki) bestimmt werden. Wenn eine signifikante zeitabhängige Hemmung beobachtet wird, können die mechanismusbasierten Inaktivierungsparameter (KI und kinact) bestimmt werden. Bei diesen Parametern kann die Pharmakometrie eine zusätzliche Orientierungshilfe bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Studie bieten.