Die Induktion von CYP-Enzymen (typischerweise CYP1A2, CYP2B6 und CYP3A4) wird in vitro nach Exposition gegenüber dem Prüfling in Monolayer-Kulturen menschlicher Hepatozyten gemessen.
Erste Experimente sollten das Potenzial untersuchen, CYP1A2-, CYP2B6- und CYP3A4-Enzyme zu induzieren. Wenn eine Induktion von CYP3A4-Enzymen beobachtet wird, sollte der Sponsor auch das Induktionspotenzial von CYP2C-Enzymen (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19) bewerten. Die Effekte werden dann mit denen verglichen, die durch Positivkontrollinduktoren der untersuchten CYP-Enzyme hervorgerufen werden. Darüber hinaus können ex vivo Tierlebern (typischerweise Maus, Ratte, Hund oder Affe) zu subzellulären Fraktionen verarbeitet und zur Bewertung von Testartikel vermittelten Effekten auf arzneimittelmetabolisierende Enzyme nach In-vivo-Verabreichung während Sicherheitsbewertungsstudien verwendet werden.
Regulatorische Überlegungen für Enzyminduktionsstudien
Diese Studien werden sowohl von der FDA als auch von der EMA empfohlen, um die Induktion von Cytochrom P450 für CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 und CYP3A4 zu bewerten, bevor sie in First-in-Human-Studien aufgenommen werden.
Induktionsdaten werden verwendet, um die Anforderungen und den Umfang klinischer DDI-Studien zu bestimmen.
Methode
- Prüfsystem: Einzelne humane Spenderhepatozyten, kryokonserviert
- CYP-Enzyme bewertet: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
- Konzentrationen von Testsubstanzen: Ausgewählt, um die vorhergesagte klinische Exposition (0,1 – 10X Cmax) abzudecken, sofern nicht durch die Löslichkeit begrenzt. Wählen Sie 5 Konzentrationen für die Zytotoxizität, 7 für die mRNA-Induktion und 3 für die Induktion der Enzymaktivität
- Inkubationszeit: 72 Stunden, mit aktualisiertem Medium alle 24 Stunden.
Zytotoxizität
In vorläufigen Assays werden Hepatozyten von einem Spender in Gegenwart eines Testartikels (fünf Konzentrationen) oder einer Positivkontrolle Tamoxifen (50 μM) in Dreifachansätzen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert, wobei der Austausch des Mediums mit oder ohne Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden erfolgt. Nach 72 Stunden wird die Lebensfähigkeit der Hepatozyten mit dem MTS-Assay bewertet. Die Ergebnisse werden verwendet, um die Konzentrationen der ungiftigen Testartikel für die Induktionsassays zu bestimmen.
Stabilität
In Verbindung mit dem Zytotoxizitätstest werden Mediumproben entnommen, um die Konzentrationen des Prüflings im Zeitverlauf zu beurteilen.
CYP mRNA-Induktion
Hepatozyten von drei Spendern werden in Gegenwart oder Abwesenheit von Testsubstanzen (sieben Konzentrationen) oder Kontrollinduktoren (siehe unten) in Dreifachansätzen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert, wobei der Austausch des Mediums ± Testsubstanz oder der Kontrollen alle 24 Stunden erfolgt. Nach 72 Stunden wird die mRNA extrahiert und die Genexpression durch quantitative Echtzeit-PCR bestimmt. Die Konzentration jeder CYP-mRNA wird auf die eines endogenen Kontrollgens (z. B. GAPDH) normalisiert. Die Induktion der CYP-Genexpression wird dann mit der 2-ΔΔCT-Methode berechnet. Ein vom Testartikel abhängiger Anstieg der CYP-mRNA-Spiegel ≥2-fach im Vergleich zur Vehikelkontrolle oder eine Reaktion ≥20 % der Reaktion der Positivkontrollen können als positive Ergebnisse interpretiert werden.
CYP-Enzym-Induktion
Hepatozyten von drei Spendern werden in Gegenwart oder Abwesenheit von Testartikeln (drei Konzentrationen) oder Kontrollinduktoren (wie oben) in dreifacher Ausführung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 gezüchtet, wobei der Austausch des Mediums ± Testartikel oder der Kontrollen alle 24 Stunden erfolgt. Nach 72 Stunden werden die Hepatozyten 2 Stunden lang in frischem Medium inkubiert, das geeignete CYP-Substrate (siehe unten) enthält, danach werden die Reaktionen beendet und Proben für die Analyse von Metaboliten (siehe unten) mit einer Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analysemethode (LC-MS) entnommen. Testartikelabhängige Erhöhungen der CYP-Enzymaktivität um das 2-fache oder mehr im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle oder eine Reaktion ≥ 20 % der Reaktion der Positivkontrollen können als positive Ergebnisse interpretiert werden.
