Zum Hauptinhalt wechseln

Arzneimittelwechselwirkungen und Transporter

Membran-Wirkstofftransporter, die sich in vielen Barrieregeweben des Körpers befinden, können mit Arzneimitteln interagieren, um die Absorption, Verteilung und Eliminierung in vivo zu beeinflussen, und sind die Ursache für klinisch relevante Arzneimittelwechselwirkungen (DDIs). Die Identifizierung des Prüflings als Substrat oder Inhibitor von Transportern kann klinisch relevante veränderte Expositionen und Toxizitäten von gleichzeitig verabreichten Arzneimitteln erklären. Die intestinale Permeabilität eines Medikaments ist ein wichtiger Faktor, der den absorbierten Anteil bestimmt und kann mit dem Caco-2-Monolayer-Transportassay bewertet werden.

Regulatorische Überlegungen zu Transporter-Wechselwirkungen

Diese Studien werden sowohl von der FDA als auch von der EMA empfohlen, um Transporterwechselwirkungen zu bewerten, bevor sie in Erstanwendungsstudien am Menschen aufgenommen werden. Transporter-Studien weisen auf potenzielle Probleme beim Erreichen wirksamer Plasmakonzentrationen von gleichzeitig verabreichten Medikamenten hin, die auf die Auswirkungen eines Medikaments auf die Absorption oder Verteilung zurückzuführen sind.

Mehrere Transporter interagieren mit Medikamenten, die klinisch eingesetzt werden. Zu den empfohlenen Testpersonen gehören:

  • ATP-Bindungskassette (ABC) Effluxtransporter, P-Glykoprotein (P-gp), Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) und Gallensalz-Exportpumpe (BSEP).
  • Solut-Carrier (SLC) Aufnahmetransporter Organic Anion Transporter (OAT) 1 und OAT3, Organic Cation Transporter (OCT) 2, Organic Anion Transporting Polypeptide (OATP) 1B1, OATP1B3 und Multidrug and Toxin Extrusion (MATE) 1 und MATE2 K.

Methoden für Transporter-Wechselwirkungen

  • Prüfsystem: Transfizierte Zelllinien, die einen einzelnen Uptake (SLC)-Transporter oder eine Vektorkontrolle exprimieren, kultiviert in Monoschichten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2.
  • Assay-Puffer: HBSS mit HEPES, pH 7,4
  • Nur für MATE-Transporter werden die Zellen mit NH4Cl vorbehandelt, um einen pH-Gradienten über die Zellmembran einzuführen, der für die MATE-Aufnahmeaktivität erforderlich ist.
  • Konzentrationen von Testsubstanzen: 2 für Substrat-Assays, 2 für Inhibitionsassays
  • Radioaktiv markierte Sondensubstrate, die für jeden Transporter spezifisch sind
  • Positive Kontrollinhibitoren für jeden Transporter

Transporter-exprimierende Zellen in Kultur werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 mit einem Assay-Puffer vorinkubiert 30 Minuten lang. MATE-exprimierende Zellen werden mit NH4CI behandelt, um einen pH-Gradienten über die Zellmembran zu erzeugen und so die Aufnahmeaktivität zu erleichtern. Ein Sondensubstrat oder ein Prüfling wird zu den Triplikatbrunnen hinzugefügt, und Inhibitoren werden gegebenenfalls hinzugefügt. Die Platten werden je nach Transporter für eine Dauer von 2 bis 10 Minuten inkubiert. Der Puffer wird aspiriert, und die Zellen werden gewaschen, dann lysiert, gesammelt und mittels LC-MS auf das Vorhandensein des Prüflings analysiert.

Beurteilung des Substrats: Die Aufnahme des Testobjekts durch jeden Transporter allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors wird mit der Aufnahme durch die Vektorkontrolle nach einer Inkubation von 2-5 Minuten verglichen. Die Aufnahme eines Sondensubstrats durch jeden Transporter allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors und durch die Vektorsteuerung wird als Kontrollversuche durchgeführt.

Beurteilung des Inhibitors: Die Aufnahme eines Sondensubstrats durch jeden Transporter erfolgt allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors oder des Prüflings. Die Aufnahme des Sondensubstrats durch die Vektorsteuerung wird ebenfalls als Kontrolle durchgeführt. Wenn eine Hemmung beobachtet wird, kann der IC50 bestimmt werden.

  • Prüfsystem: Caco-2 humane Darmepithelzellen, kultiviert auf Transwell-Platten in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO2 für 21-24 Tage
  • Assay-Puffer: HBSS mit HEPES, pH 7,4 sowohl in apikalen als auch in basolateralen Kammern
  • Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird vor dem Assay gemessen, um die Bildung von tight junctions zu bestätigen
  • Konzentrationen von Testsubstanzen: 2 für Substrat-Assays, 2 für Inhibitionsassays
  • Radioaktiv markierte Permeabilitätsmarker Mannitol und Koffein werden verwendet, um die Bildung von tight junctions zu verifizieren
  • Es werden radioaktiv markierte Sondensubstrate verwendet, die für jeden Transporter spezifisch sind
  • Selektive Inhibitoren als Positivkontrollen für jeden Transporter mit Negativkontrollen für Inhibitoren

Die scheinbare Permeabilität von Prüfartikel und Sondensubstraten wird sowohl in apikaler bis basolateraler (A-B) als auch in basolateraler bis apikaler (B-A) Richtung auf Transwell-Platten bestimmt. Nach 30-minütiger Vorinkubation in einem Assay-Puffer in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 wird die Sonde oder das Testobjekt in eine Kammer (Donor) mit einem Leer-Puffer in die gegenüberliegende Kammer (Empfänger) gegeben. Gegebenenfalls werden dann Inhibitoren in beide Kammern gegeben. Die Platten werden bei 37 °C in 5 % CO2  für 2 Stunden inkubiert. Proben aus der Spender- und Empfängerkammer werden entnommen und mittels LC-MS auf das Vorhandensein des Testobjekts analysiert. Anschließend werden die Durchlässigkeit des Testartikels und das Ausflussverhältnis bestimmt.

Beurteilung des Substrats: Der Transport des Prüflings allein oder in Gegenwart von selektiven Inhibitoren wird in beide Richtungen bestimmt. Der Transport eines Sondensubstrats für jeden Transporter allein oder in Gegenwart von selektiven Inhibitoren wird als Kontrollen durchgeführt.

Beurteilung des Inhibitors: Der Transport eines Sondensubstrats wird nach einer 2-stündigen Inkubation allein oder in Gegenwart des selektiven Inhibitors oder des Prüflings in beide Richtungen bestimmt. Wird eine Hemmung des Effluxtransports beobachtet, kann der IC50 bestimmt werden.

  • Prüfsystem: Membranvesikel (50 μg/Well), die den Efflux (ABC)-Transporter BSEP exprimieren.
  • Konzentrationen von Testsubstanzen: 2 für Substrat-Assays; 2 für Inhibitionsassays.
  • Adenosintriphosphat (ATP)-abhängige Aktivität gemessen, wobei Adenosinmonophosphat (AMP) als Kontrolle verwendet wurde.
  • Radioaktiv markiertes Sondensubstrat spezifisch für BSEP
  • Positive Kontrollinhibitoren für jeden Transporter

Membranvesikel, die BSEP exprimieren, und der Testartikel oder das Sondensubstrat werden in 96-Well-Platten inkubiert. Die Aufnahme wird durch die Zugabe von Adenosintriphosphat (ATP) eingeleitet, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C. Adenosinmonophosphat (AMP) wird parallel als Negativkontrolle eingesetzt. Die Aufnahme wird durch Vakuumabsaugung und zweimaliges Spülen der Filter mit überschüssigem eiskalten Transportpuffer beendet. Anschließend werden Vesikel aus Filterplatten extrahiert, um die LC-MS-Quantifizierung und die Berechnung der ATP-abhängigen Aktivität zu ermöglichen.

Beurteilung des Substrats: Die Aufnahme des Prüflings allein und mit selektivem Inhibitor in Gegenwart von ATP wird mit der Aufnahme in Gegenwart von AMP verglichen.  Die Aufnahme eines Sondensubstrats durch BSEP allein und in Gegenwart eines selektiven Inhibitors wird als Kontrollen durchgeführt.

Beurteilung des Inhibitors: Die Aufnahme eines Sondensubstrats erfolgt allein und in Gegenwart eines selektiven Inhibitors oder des Prüfobjekts; Die Aufnahme in Gegenwart von ATP wird mit der Aufnahme in Gegenwart von AMP verglichen.  Wird eine Hemmung der ATP-abhängigen Aufnahme der Prüfsubstanz beobachtet, kann der IC50 bestimmt werden.

 

Ergebnisse

Diese Assays werden Substrat- oder Hemmungswechselwirkungen mit Membran-Wirkstofftransportern identifizieren und profilieren. Die Daten beschreiben das Ausmaß der Aufnahme und/oder des Effluxs, die Permeabilität des Prüflings, die Transporterhemmung und gegebenenfalls die IC50-Werte .

Diese Daten können auch verwendet werden, um Risiken von Arzneimittelwechselwirkungen auf der Grundlage wahrscheinlicher Wechselwirkungen mit begleitenden Therapeutika zu bewerten und neue Arzneimittelkandidaten einzuschätzen. Wenn Wechselwirkungen beobachtet werden, kann die Pharmakometrie zusätzliche Hinweise bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Prüfung geben.