ddPCR技術は、核酸サンプルを水油エマルジョン中の定義された体積の数万個の微小液滴に分割することに基づいています。 標的核酸配列の増幅は、標準的なTaqMan®プローブベースのアッセイで使用されるのと同様のワークフローと試薬を使用して、各マイクロドロップレット内で実行されます。 増幅後の蛍光検出に基づいて、各液滴がカウントされ、PCR陽性またはPCR陰性のいずれかとしてスコアリングされます。 元のサンプル中のターゲットDNA/RNAテンプレート濃度(コピー/μl)は、ポアソン分布を使用して定量されます1,2
ddPCRは、標準曲線や参照標準から外挿することなく、サンプル量あたりの核酸配列の絶対量を測定できます。 qPCRでは検出できない非常に少量のサンプル量で小さな変化を検出できます。ddPCRの結果は、各サンプルに何千ものデータポイントがあるため、qPCRの結果よりも正確で、感度が高く、精密です。
ddPCRは、ctDNA、cfDNA/RNA、mRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、siRNAなど、プライマーやプローブを構築できるあらゆるタイプのDNAまたはRNA配列を検出できます。
細胞および組織の溶解物、組織、体液(血液、脳脊髄液、涙、尿、唾液など)、細胞上清、合成核酸製品など、DNAまたはRNA配列を含む任意のサンプルをddPCRに使用できます。
qPCRと同様に、通常の実行には約4時間かかります。 ddPCRワークフローでは、数万ナノリットルサイズのオイルマイクロドロップレットを作成するために追加のステップが必要です。 ただし、このステップにかかる余分な時間は、ddPCRリーダーの簡素化されたデジタル分析によって打ち消されます。
抽出/単離/精製されたDNA/RNAからなるサンプルは、Bio-Rad QX200 ddPCRシステムですぐに実行および分析できます。 細胞上清および細胞/組織溶解物は、ddPCRアッセイを実行する前に、DNAまたはRNAの抽出/単離/精製が必要です。 Labcorpのラボスタッフの安全を確保するために、組織、体液、細胞上清は、Labcorpのラボで取り扱う前に必須の病原体検査が必要です。 さらに、すべてのヒト由来の材料(組織または体液)、微生物またはウイルス、バイオハザード汚染の可能性がある生物学的システムで作成された製品、および組換えおよび/または合成核酸分子は、材料を取り扱う前に、バイオセーフティ登録フォームに記入し、その後Labcorp PCOバイオセーフティ委員会による承認を受ける必要があります。
ddPCR用のサンプルを出荷する前にDNA/RNAを抽出/単離/精製しない場合、Labcorp PCOは、凍結して出荷する前に、核酸保存液(RNAlater®、DNA/RNA ShieldTM、RNAprotect®など)で細胞および組織サンプル中の核酸を保護/安定化/保存することを推奨しています。
すべてのサンプルは、ドライアイスの入った断熱箱に入れて冷凍して出荷する必要があります。
1. QX200液滴デジタルPCRシステム。 バイオ・ラッド。https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system。
2. Taylor SC、Laperriere G、Germain H. 低存在量のターゲットを使用した遺伝子発現分析のための液滴デジタルPCRとqPCR: 可変ナンセンスから出版品質データまで。 Sci Rep. 2017;7:2409。doi:10.1038/s41598-017-02217-x。
