Skip to main content

드롭릿 디지털 PCR(ddPCR)

Labcorp는 이제 Bio-Rad의 QX200 시스템을 사용하여 초고감도와 고정밀도로 핵산 정량을 가능하게 하는 ddPCR 기술을 제공합니다. ddPCR을 사용하면 기존 기술로는 검출할 수 없는 분자 표적을 완벽하게 정량화할 수 있습니다.

ddPCR은 어떻게 작동하나요?

ddPCR 기술은 물-오일 에멀전 내에서 정해진 부피의 수만 개의 미세액적으로 핵산 샘플을 분할하는 것을 기반으로 합니다. 각 미세소적 내에서 표적 핵산 서열의 증폭은 표준 TaqMan® 프로브 기반 분석에서 사용되는 것과 유사한 작업 흐름과 시약을 사용하여 수행됩니다. 증폭 후 형광 검출을 기준으로 각 물방울을 세고 PCR 양성 또는 PCR 음성으로 점수를 매깁니다. 원래 샘플의 표적 DNA/RNA 템플릿 농도(복사본/µl)는 포아송 분포를 사용하여 정량화됩니다.1,2

ddPCR의 응용 분야:

  • 세포 치료 샘플에서 통합된 CAR 시퀀스 수 정량화
  • 시간 경과에 따른 연구 대상자의 혈액/조직 내 CAR 시퀀스 수를 정량화합니다.
  • 유전자 전달 후 세포/조직에서 통합된 과잉발현 구조의 수를 정량화합니다.
  • 혈액 내 순환 종양 DNA(ctDNA)를 검출하고 정량화합니다.
  • 조직/종양 내 치료 박테리아를 정량화합니다.
  • 미세위성 불안정성을 정량화하여 종양 돌연변이 부담을 평가합니다.
  • BRCA1, BRCA2, PT53, HER2, RAS, RB1, APC, ErbB2, PI3KCA, MYC 또는 CCND1과 같은 발암 유전자 또는 종양 억제 유전자의 희귀 돌연변이를 감지합니다.
  • 샘플 간 복사 수 변화 확인
  • 샘플/처리 간 유전자 발현 수준의 작은 배수 차이 측정
  • SNP 유전자형 분석
  • 바이러스 부하/역가 분석
  • 미생물/병원균 검출
  • 차세대 시퀀싱 라이브러리 정량화
  • 게놈 편집 이벤트(CRISPR의 NHEJ 및 HDR)를 검증/정량화합니다. 

qPCR에 비해 ddPCR의 장점:

  • 표준 곡선이나 연속 희석이 필요 없이 핵산의 절대 정량화
  • ddPCR은 qPCR에 비해 각 샘플에 대해 수만 개의 분할 PCR 반응을 생성하므로 더 높은 정확도를 제공합니다.
  • 덜 풍부한 표적 핵산 사본을 감지하는 데 있어 정확도, 견고성 및 민감도가 향상되었습니다.
  • 실시간 PCR로는 검출할 수 없는 샘플 중 표적 핵산 수치의 미묘한 변화 모니터링
  • 참조 또는 교정 표준이 필요 없는 간소화된 정량화
  • 소량 샘플 양 요구 사항

ddPCR FAQs

ddPCR은 표준 곡선이나 참조 표준에서 외삽하지 않고도 샘플 부피당 핵산 서열의 절대적인 양을 측정할 수 있습니다. ddPCR은 qPCR에서 감지할 수 없는 매우 적은 양의 샘플에서 작은 배수 변화를 감지할 수 있습니다. ddPCR 결과는 각 샘플에 대한 수천 개의 데이터 포인트로 인해 qPCR 결과보다 더 정확하고 민감하며 정밀합니다.

ddPCR은 프라이머와 프로브를 구성하여 ctDNA, cfDNA/RNA, mRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, miRNA 또는 siRNA와 같은 모든 유형의 DNA 또는 RNA 서열을 감지할 수 있습니다.

세포 및 조직 용해물, 조직, 생물학적 체액(혈액, 뇌척수액, 눈물, 소변, 타액 등), 세포 상층액 또는 합성 핵산 제품 등 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는 모든 샘플을 ddPCR에 사용할 수 있습니다.

qPCR과 마찬가지로 일반적인 실행에는 약 4시간이 걸립니다. ddPCR 작업 흐름에는 수만 개의 나노리터 크기의 오일 미세방울을 만들기 위한 추가 단계가 필요합니다. 그러나 이 단계에 소요되는 추가 시간은 ddPCR 판독기의 간소화된 디지털 분석으로 인해 상쇄됩니다.

추출/분리/정제된 DNA/RNA로 구성된 샘플은 Bio-Rad QX200 ddPCR 시스템으로 즉시 실행하고 분석할 수 있습니다. ddPCR 분석을 실시하기 전에 세포 상층액과 세포/조직 용해물에서 DNA 또는 RNA 추출/분리/정제가 필요합니다. Labcorp 연구실 직원의 안전을 보장하기 위해 조직, 생물학적 체액 및 세포 상층액을 Labcorp 연구실에서 취급하기 전에 필수 병원체 검사를 실시해야 합니다. 또한, 인간이 공급하는 모든 재료(조직이나 체액), 미생물이나 바이러스, 잠재적인 생물학적 위험 오염이 있는 생물학적 시스템에서 생성된 제품, 재조합 및/또는 합성 핵산 분자는 생물 안전 등록 양식을 작성해야 하며, 재료를 취급하기 전에 Labcorp PCO 생물 안전 위원회의 승인을 받아야 합니다.

ddPCR을 위해 샘플을 배송하기 전에 DNA/RNA를 추출/분리/정제하지 않는 경우, Labcorp PCO에서는 세포 및 조직 샘플의 핵산을 핵산 보존 용액(예: RNAlater®, DNA/RNA ShieldTM 또는 RNAprotect®)으로 보호/안정화/보존한 후 동결하여 배송할 것을 권장합니다.

모든 샘플은 건조 얼음이 들어 있는 단열 상자에 넣어 냉동 상태로 배송해야 합니다.

참고문헌

1. QX200 Droplet 디지털 PCR 시스템. 바이오-라드. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.

2. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. 저농도 표적 유전자 발현 분석을 위한 Droplet Digital PCR 대 qPCR: 변수적인 넌센스부터 출판 품질 데이터까지. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10.1038/s41598-017-02217-x.