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反応表現型解析

反応表現型解析研究では、プールされたヒト肝臓ミクロソームでインキュベートされた親試験品の消失に対する酵素アイソフォーム特異的阻害剤の影響を評価します。 組換え個々の薬物代謝酵素アイソフォームとのインキュベーションにより、酵素活性が確認されます。 試験品の代謝に関与する酵素を評価すると、単一酵素や多型発現酵素によって触媒される代謝経路などの潜在的な障害が浮き彫りになる可能性があります。

  • 規制遵守

  • 包括的な酵素評価

  • アイソフォーム特異的化学阻害剤および組換え酵素

反応表現型解析研究における規制上の考慮事項

CYP酵素 (CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、およびCYP3A) の調査は、薬物間相互作用 (DDI) ガイドラインに従って薬物のクリアランス経路をよりよく理解するための初期調査として推奨されます。 これらの主要なCYP酵素が薬物の代謝に関与していない場合は、次のような他の第I相および第II相酵素を評価する必要があります。

  • CYP酵素(CYP2A6、CYP2J2、CYP4F2、およびCYP2E1)
  • アルデヒドオキシダーゼ(AO)、カルボキシルエステラーゼ(CES)、モノアミンオキシダーゼ(MAO)、フラビンモノオキシゲナーゼ(FMO)、キサンチンオキシダーゼ(XO)、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ADH/ALDH)などの非CYP酵素
  • UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)およびスルホトランスフェラーゼ(SULT)を含む抱合酵素

反応表現型解析は、被験物質の代謝された割合に関する情報を提供し、影響を受けるDDIの可能性の評価、臨床研究デザインへの情報提供、薬物動態の個人差の予測、および遺伝子多型の影響の評価に使用できます。

方法

  • テストシステム: プールされたヒト肝ミクロソームと、必要な補因子を持つ組換え個別発現ヒト酵素
  • CYPアイソフォーム: CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、およびCYP3A4。 (他のCYP、UGT、および薬物代謝酵素も利用できます)。
  • 確認には、アイソフォーム特異的化学阻害剤と組換え酵素が使用されます。

試験品は、リン酸緩衝液中のミクロソームとともに事前に少なくとも5分間インキュベートされます。 被験物質の代謝は、NADPHまたはその他の適切な補因子の添加によって開始されます。 有機溶媒の添加によってインキュベーションを終了し、LC-MS（液体クロマトグラフィー-質量分析）を使用してサンプルの試験物質および/またはその代謝物を分析します。

フェーズI-インビトロインキュベーション条件の最適化

試験品は、NADPHまたはその他の適切な補因子の存在下で、ミクロソームの濃度範囲(通常0.1〜1 mgタンパク質/mL)で4つの時間点で、最大60分間、3回インキュベートされます。

対照インキュベーションは、補因子がない場合に行われます。 ミクロソーム濃度のインキュベーション条件と、試験品の消失の線形速度を生み出す時点を使用して、フォローアップ実験を定義します。

フェーズII - 試験品代謝の速度論的分析

試験品がどれだけ早く消失するかの速度は、最適化された条件下で少なくとも8つの濃度の試験品を3重複でインキュベーションサンプルで監視されます。 データはMichaelis-Menten曲線フィッティングを使用して分析され、試験品の速度論的パラメータKm およびVmax が決定されます。

フェーズIII - CYP特異的化学阻害剤を使用した阻害分析

試験品は、Kmより低い濃度で、酵素選択的化学阻害剤の有無にかかわらず、プールされたヒト肝ミクロソームと共に3回インキュベートされます。 対照インキュベーションは、阻害剤がない場合に、ビヒクル溶媒のみを使用して実行されます。

フェーズIV - 組換えヒトCYPを使用した代謝

試験品は、Kmより低い濃度で、さまざまな組換えヒトCYPおよびUGT、その他のDME（上記参照）と共に3回インキュベートされます。 0分と60分での試験品の相対濃度を測定します。 

 

成果物

これらのアッセイは、in vitroで試験品の代謝に関与する酵素と代謝の程度を特定します。 試験品の消失および/または代謝産物形成の速度論が決定されます。in vitro代謝評価は、関与する主要な酵素を特定し、ファーストインヒューマンテストの前に潜在的なin vivoクリアランスメカニズムのリスクを警告します。