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PCR numérique en gouttelettes (ddPCR)

Labcorp propose désormais la technologie ddPCR pour permettre la quantification des acides nucléiques avec ultrasensibilité et haute précision à l’aide du système QX200 de Bio-Rad. La ddPCR permet une quantification absolue de cibles moléculaires indétectables avec les techniques traditionnelles.

Comment fonctionne la ddPCR ?

La technique ddPCR est basée sur la partition d’échantillons d’acides nucléiques en dizaines de milliers de microgouttelettes de volume défini dans une émulsion eau-huile. L’amplification des séquences d’acides nucléiques cibles est effectuée dans chaque microgouttelettes à l’aide d’un flux de travail et de réactifs similaires à ceux utilisés dans un test standard basé sur une sonde TaqMan®. Sur la base de la détection de fluorescence après amplification, chaque microgouttelettes est comptée et notée comme PCR-positive ou PCR-négative. La concentration cible de matrice d’ADN/ARN (copies/μl) dans l’échantillon original est quantifiée à l’aide d’une distribution de Poisson.1,2

Applications de la ddPCR :

  • Quantifier le nombre de séquences CAR intégrées dans les échantillons de thérapie cellulaire
  • Quantifier le nombre de séquences CAR dans le sang/les tissus des sujets de l’étude au fil du temps
  • Quantifier le nombre de constructions de surexpression intégrées dans les cellules/tissus après l’administration de gènes
  • Détecter et quantifier l’ADN tumoral circulant (ADNct) dans le sang
  • Quantifier les bactéries thérapeutiques dans les tissus/tumeurs
  • Évaluer la charge mutationnelle tumorale en quantifiant l’instabilité des microsatellites
  • Détecter des mutations rares dans des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs tels que BRCA1, BRCA2, TP53, HER2, RAS, RB1, APC, ErbB2, PI3KCA, MYC ou CCND1
  • Déterminer la variation du nombre de copies entre les échantillons
  • Mesurer les petites différences de pli dans les niveaux d’expression génique entre les échantillons/traitements
  • Génotypage SNP
  • Analyse de la charge virale et du titre
  • Détection microbienne/pathogène
  • Quantification de banques de séquençage de nouvelle génération
  • Vérifier/quantifier les événements d’édition génomique (NHEJ et HDR de CRISPR) 

Avantages de la ddPCR par rapport à la qPCR :

  • Quantification absolue des acides nucléiques sans avoir besoin de courbes standard ou de dilutions en série
  • La ddPCR offre une plus grande précision car elle génère des dizaines de milliers de réactions de PCR partitionnée pour chaque échantillon par rapport à la qPCR
  • Précision, robustesse et sensibilité accrues dans la détection de copies d’acides nucléiques cibles moins abondantes
  • Surveillance de changements subtils dans les niveaux d’acides nucléiques cibles parmi les échantillons qui ne peuvent pas être détectés par PCR en temps réel
  • Quantification simplifiée sans avoir besoin de références ou d’étalons
  • Exigence d’un petit volume d’échantillon

FAQ sur la ddPCR

La ddPCR peut mesurer des quantités absolues de séquences d’acides nucléiques par volume d’échantillon sans extrapolation à partir de courbes standard ou d’étalons de référence. Il peut détecter de petits changements de faible ampleur dans de très faibles volumes d’échantillons qui peuvent ne pas être détectés par qPCR. Les résultats de la ddPCR sont plus précis, sensibles et précis que les résultats de la qPCR en raison des milliers de points de données pour chaque échantillon.

La ddPCR peut détecter tous les types de séquences d’ADN ou d’ARN pour lesquelles des amorces et des sondes peuvent être construites, telles que l’ADNct, l’ADNcf/ARN, l’ARNm, l’ARNr, l’ARNsn, l’ARNsno, l’ARNmi ou l’ARNsi.

Tout échantillon contenant des séquences d’ADN ou d’ARN peut être utilisé dans la ddPCR, comme les lysats cellulaires et tissulaires, les tissus, les fluides biologiques (sang, liquide céphalo-rachidien, larmes, urine, salive, etc.), les surnageants cellulaires ou les produits d’acides nucléiques synthétiques.

Comme pour la qPCR, une exécution typique dure environ quatre heures. Le flux de travail ddPCR nécessite une étape supplémentaire pour créer les dizaines de milliers de microgouttelettes d’huile de la taille d’un nanolitre. Cependant, le temps supplémentaire pour cette étape est annulé par l’analyse numérique simplifiée du lecteur ddPCR.

Les échantillons composés d’ADN/ARN extrait/isolé/purifié peuvent être analysés immédiatement avec le système ddPCR Bio-Rad QX200. Les surnageants cellulaires et les lysats cellulaires/tissulaires nécessiteront l’extraction/l’isolement/la purification de l’ADN ou de l’ARN avant que le test ddPCR puisse être effectué. Afin d’assurer la sécurité du personnel de laboratoire Labcorp, les tissus, les fluides biologiques et les surnageants cellulaires devront faire l’objet d’analyses pathogènes obligatoires avant d’être manipulés dans les laboratoires Labcorp. De plus, toutes les matières d’origine humaine (tissus ou fluides corporels), les micro-organismes ou les virus, les produits créés dans des systèmes biologiques présentant un risque potentiel de contamination biologique et les molécules d’acide nucléique recombinantes et/ou synthétiques nécessitent la complétion d’un formulaire d’enregistrement de biosécurité et l'approbation subséquente par le comité de biosécurité du BCP de Labcorp avant la manipulation des matières.

Si vous n’extrayez pas, n’isolez pas ou ne purifiez pas l’ADN ou l’ARN avant d’expédier les échantillons pour la ddPCR, Labcorp PCO recommande de protéger/stabiliser/préserver les acides nucléiques dans les échantillons de cellules et de tissus à l’aide d’une solution de préservation des acides nucléiques (telle que RNAlater®, DNA/RNA ShieldTM ou RNAprotect®) avant de les congeler et de les expédier.

Tous les échantillons doivent être expédiés congelés dans une boîte isotherme avec de la glace sèche.

Références

1. Système PCR numérique QX200 Droplet. BIO-RAD. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.

2. Taylor SC, Laperrière G, Germain H. PCR numérique en gouttelettes par rapport à qPCR pour l’analyse de l’expression génique avec des cibles peu abondantes : de la variabilité aux données de qualité de publication. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10.1038/s41598-017-02217-x.