Die ddPCR-Technik basiert auf der Aufteilung von Nukleinsäureproben in Zehntausende von Mikrotröpfchen mit definiertem Volumen in einer Wasser-Öl-Emulsion. Die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenzen erfolgt innerhalb jedes Mikrotröpfchens unter Verwendung eines ähnlichen Arbeitsablaufs und ähnlicher Reagenzien wie in einem standardmäßigen TaqMan®-Sonden-basierten Assay. Basierend auf der Fluoreszenzdetektion nach der Amplifikation wird jedes Tröpfchen gezählt und entweder als PCR-positiv oder PCR-negativ bewertet. Die DNA/RNA-Ziel-Template-Konzentration (Kopien/μl) in der Originalprobe wird mit Hilfe einer Poisson-Verteilung quantifiziert.1,2
Mit der ddPCR können absolute Mengen an Nukleinsäuresequenzen pro Probenvolumen gemessen werden, ohne dass Extrapolationen von Standardkurven oder Referenzstandards erforderlich sind. Es kann kleine Änderungen im Faltungsgrad in sehr geringen Probenvolumina nachweisen, die mit der qPCR möglicherweise nicht nachgewiesen werden können. ddPCR-Ergebnisse sind aufgrund der Tausenden von Datenpunkten für jede Probe genauer, empfindlicher und präziser als qPCR-Ergebnisse.
Mit der ddPCR können alle Arten von DNA- oder RNA-Sequenzen nachgewiesen werden, für die Primer und Sonden konstruiert werden können, wie z. B. ctDNA, cfDNA/RNA, mRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, miRNA oder siRNA.
Jede Probe, die DNA- oder RNA-Sequenzen enthält, kann in der ddPCR verwendet werden, wie z. B. Zell- und Gewebelysate, Gewebe, biologische Flüssigkeiten (Blut, Liquor, Tränen, Urin, Speichel usw.), Zellüberstände oder synthetische Nukleinsäureprodukte.
Wie bei der qPCR dauert ein typischer Lauf etwa vier Stunden. Der ddPCR-Workflow erfordert einen zusätzlichen Schritt, um die Zehntausende von nanolitergroßen Öl-Mikrotröpfchen zu erzeugen. Die zusätzliche Zeit für diesen Schritt wird jedoch durch die vereinfachte digitale Analyse des ddPCR-Readers zunichte gemacht.
Proben, die aus extrahierter/isolierter/gereinigter DNA/RNA bestehen, können sofort mit dem Bio-Rad QX200 ddPCR System verarbeitet und analysiert werden. Zellüberstände und Zell-/Gewebelysate erfordern eine DNA- oder RNA-Extraktion/Isolierung/Aufreinigung, bevor der ddPCR-Assay durchgeführt werden kann. Um die Sicherheit des Laborpersonals von Labcorp zu gewährleisten, müssen Gewebe, biologische Flüssigkeiten und Zellüberstände vor der Handhabung in den Labors von Labcorp obligatorischen Erregertests unterzogen werden. Darüber hinaus müssen alle Materialien menschlichen Ursprungs (Gewebe oder Körperflüssigkeiten), Mikroorganismen oder Viren, Produkte, die in biologischen Systemen mit potenzieller biologischer Kontamination hergestellt wurden, sowie rekombinante und/oder synthetische Nukleinsäuremoleküle das Ausfüllen eines Biosicherheitsformulars und die anschließende Genehmigung durch das Labcorp PCO Biosafety Committee vor dem Umgang mit den Materialien erfordern.
Wenn Sie die DNA/RNA vor dem Versand der Proben für die ddPCR nicht extrahieren/isolieren/reinigen, empfiehlt Labcorp PCO, die Nukleinsäuren in Zell- und Gewebeproben vor dem Einfrieren und Versenden mit einer Nukleinsäurekonservierungslösung (z. B. RNAlater®, DNA/RNA ShieldTM oder RNAprotect®) zu schützen/zu stabilisieren/konservieren.
Alle Proben sollten gefroren in einer isolierten Box mit Trockeneis versendet werden.
1. QX200 Tröpfchen-Digital-PCR-System. BIO-RAD. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.
2. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR für die Genexpressionsanalyse mit niedrig abundanten Zielen: Von variablen, unzuverlässigen Daten bis hin zu Daten in Publikationsqualität. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10.1038/s41598-017-02217-x.
