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반응 표현형

반응 표현형 연구는 풀링된 인간 간 미세소체에서 배양된 모체 시험 물질의 소멸에 효소 동형체 특이적 억제제가 미치는 영향을 평가합니다. 재조합 개별 약물 대사 효소 동종체와의 배양을 통해 효소 활성을 확인할 수 있습니다. 시험 물질의 대사에 책임이 있는 효소를 평가하면 단일 효소나 다형적으로 발현되는 효소에 의해 촉매되는 대사 경로와 같은 잠재적인 위험을 강조할 수 있습니다.

  • 규정 준수

  • 종합 효소 평가

  • 동형체 특이적 화학 억제제 및 재조합 효소

반응 표현형 연구에 대한 규제 고려 사항

약물-약물 상호작용(DDI) 가이드라인에 따라 약물의 클리어런스 경로를 더 잘 이해하기 위한 초기 조사로 CYP 효소(CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 및 CYP3A)에 대한 조사가 권장됩니다. 이러한 주요 CYP 효소가 약물 대사에 관여하지 않는 경우 다음을 포함하여 다른 1상 및 2상 효소를 평가해야 합니다.

  • CYP 효소(CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 및 CYP2E1)
  • 알데히드 산화효소(AO), 카르복실에스테라제(CES), 모노아민 산화효소(MAO), 플라빈 모노산소화효소(FMO), 잔틴 산화효소(XO), 알코올/알데히드 탈수소효소(ADH/ALDH)를 포함한 비CYP 효소
  • UDP 글루쿠로노실 전이효소(UGT) 및 설포트랜스퍼라제(SULT)를 포함한 접합 효소

반응 표현형 분석은 시험 물질의 대사 분율에 대한 정보를 제공하며 피해자 DDI 가능성을 평가하고, 임상 연구 설계에 대한 정보를 제공하고, 약물동태학에서 개인 간 변동성을 예측하고, 유전자 다형성의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

방법

  • 테스트 시스템: 필요한 보조 인자를 포함하는 풀링된 인간 간 미세소체 및 재조합 개별 발현 인간 효소
  • CYP 동형체: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4. (다른 CYP, UGT 및 약물 대사 효소도 사용 가능합니다).
  • 확인을 위해 동형체 특이적 화학적 억제제와 재조합 효소가 사용됩니다.

시험물질은 인산완충액에서 미세소체와 함께 최소 5분간 미리 배양됩니다. 시험 물질의 대사는 NADPH나 다른 적절한 보조 인자를 첨가하여 시작됩니다. 배양은 유기 용매를 첨가하여 종료한 후, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 샘플의 시험 물질 및/또는 대사산물을 분석합니다.

1단계 - 시험관 내 배양 조건 최적화

시험 물질은 NADPH 또는 기타 적절한 보조 인자의 존재 하에 최대 60분 동안 다양한 미세소체 농도(일반적으로 0.1~1mg 단백질/mL)로 3회 반복 배양됩니다.

보조 인자가 없는 조건에서 대조군 배양을 실시합니다. 미세소체 농도의 배양 조건과 시험 물질의 소실 속도가 선형적으로 나타나는 시점은 후속 실험을 정의하는 데 사용됩니다.

2단계 - 시험 물질 대사의 동역학 분석

시험 물질이 얼마나 빨리 사라지는지에 대한 속도는 최적화된 조건에서 최소 여덟 가지 농도의 시험 물질을 3중으로 하여 배양 샘플에서 모니터링됩니다. 데이터는 Michaelis-Menten 곡선 피팅을 사용하여 분석되고, 시험 물질에 대해 동역학 매개변수 Km와 Vmax가 결정됩니다.

3상 - CYP 특정 화학 억제제를 사용한 억제 분석

시험물질은 인간 간 미세소체와 함께 효소 선택적 화학 억제제의 부재 또는 존재 하에 농도 <Km에서 3회 배양됩니다. 대조군 배양은 억제제가 없는 상태에서 운반용 용매만을 사용하여 수행됩니다.

4상 - 재조합 인간 CYP를 사용한 대사

시험물질은 재조합 인간 CYPs, UGTs 및 기타 DME와 함께 농도 <Km에서 3회 배양됩니다. 0분과 60분에서 시험 물질의 상대 농도를 측정합니다. 

 

성과물

이러한 분석은 시험 물질이 시험관 내에서 대사되는 정도와 그 원인이 되는 효소를 식별합니다. 시험물질의 소실 및/또는 대사산물 형성의 동역학을 분석합니다. 시험관 내 대사 평가를 통해 주요 효소를 파악하고, 최초 인체 시험에 앞서 잠재적인 생체 내 제거 기전의 문제점을 파악합니다.