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Fenotipado de reacción

Los estudios de fenotipado de reacciones evalúan el impacto de los inhibidores específicos de isoformas enzimáticas en la desaparición de un artículo de prueba original incubado en microsomas hepáticos humanos combinados. La incubación con isoformas enzimáticas metabolizadoras de fármacos individuales recombinantes proporciona confirmación de las actividades enzimáticas. La evaluación de las enzimas responsables de metabolizar un artículo de prueba puede resaltar posibles responsabilidades, como las rutas del metabolismo catalizadas por enzimas individuales o por enzimas expresadas polimórficamente.

  • Cumplimiento normativo

  • Evaluación integral de enzimas

  • Inhibidores químicos específicos de isoformas y enzimas recombinantes

Consideraciones regulatorias para los estudios de fenotipado de reacciones

La investigación de las enzimas CYP (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 y CYP3A) se recomienda como una investigación inicial para comprender mejor las vías de eliminación del fármaco de acuerdo con las pautas de interacción farmacológica (DDI). Si estas enzimas CYP principales no están involucradas en el metabolismo del fármaco, se deben evaluar otras enzimas de fase I y fase II, que incluyen:

  • Enzimas CYP (CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 y CYP2E1)
  • Enzimas no CYP, incluidas la aldehído oxidasa (AO), la carboxiesterasa (CES), la monoaminooxidasa (MAO), la flavina monooxigenasa (FMO), la xantina oxidasa (XO) y la alcohol/aldehído deshidrogenasa (ADH/ALDH)
  • Enzimas conjugativas, incluidas las transferasas UDP-glucuronosilo (UGT) y las sulfotransferasas (SULT)

El fenotipado de reacción proporciona información sobre la fracción metabolizada de los artículos de prueba y se puede utilizar para evaluar el potencial de interacción fármaco-fármaco (DDI) del fármaco afectado, informar el diseño del estudio clínico, predecir la variabilidad individual en la farmacocinética y evaluar el impacto del polimorfismo genético.

Métodos

  • Sistema de prueba: Microsomas hepáticos humanos combinados y enzimas humanas recombinantes expresadas individualmente con los cofactores necesarios
  • Isoformas de CYP: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4. (También están disponibles otros CYP, UGT y enzimas metabolizadoras de fármacos).
  • Para la confirmación se utilizan inhibidores químicos específicos de isoformas y enzimas recombinantes.

El artículo de prueba se preincuba durante al menos 5 minutos con microsomas en tampón de fosfato. El metabolismo del artículo de prueba se inicia mediante la adición de NADPH u otro cofactor apropiado. Las incubaciones terminan con la adición de un disolvente orgánico y las muestras se analizan en busca del artículo de prueba y/o sus metabolitos mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).

Fase I - Optimización de las condiciones de incubación in vitro

El artículo de prueba se incuba por triplicado con un rango de concentraciones de microsomas (generalmente 0,1 – 1 mg de proteína/ml) durante cuatro puntos de tiempo hasta 60 minutos en presencia de NADPH u otro cofactor apropiado.

Las incubaciones de control se realizan en ausencia de un cofactor. Las condiciones de incubación de concentración microsomal y momento que producen una tasa lineal de desaparición del artículo de prueba se utilizan para definir experimentos de seguimiento.

Fase II - Análisis cinético del metabolismo del artículo de prueba

Las tasas de desaparición con la que desaparece el artículo de prueba se controlan en las muestras de incubación con al menos ocho concentraciones del artículo de prueba por triplicado en condiciones optimizadas. Los datos se analizan mediante el ajuste de la curva de Michaelis-Menten y se determinan los parámetros cinéticos Km y Vmax para el artículo de prueba.

Fase III - Análisis de inhibición utilizando inhibidores químicos específicos de CYP

El artículo de prueba se incuba por triplicado a una concentración <Km con microsomas hepáticos humanos agrupados en ausencia o presencia de inhibidores químicos selectivos de enzimas. Las incubaciones de control se realizan en ausencia del inhibidor utilizando solo solvente del vehículo.

Fase IV - Metabolismo mediante CYP humanos recombinantes

El artículo de prueba se incuba por triplicado a una concentración <Km con una gama de CYP humanos recombinantes y UGT, y otros DME (ver arriba). Se mide la concentración relativa del artículo de prueba a los 0 y 60 minutos. 

 

Entregables

Estos ensayos identificarán las enzimas responsables y el alcance del metabolismo del artículo de prueba in vitro. Se determina la cinética de la desaparición del artículo de prueba y/o la formación de metabolitos. La evaluación del metabolismo in vitro identifica las principales enzimas involucradas y le alerta sobre los posibles riesgos del mecanismo de eliminación in vivo antes de las primeras pruebas en humanos.