反应表型分析

反应表型研究评估酶亚型特异性抑制剂对在混合人肝微粒体中孵育的母体化合物消除的影响。与重组个体药物代谢酶同工型一起孵育可确认酶活性。评估负责代谢测试物质的酶可以突出潜在的风险，例如由单酶或多态性表达的酶催化的代谢途径。

反应表型研究的监管考虑因素

建议根据药物相互作用（DDI）指南，对 CYP 酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6 和 CYP3A）进行研究作为初步研究，以更好地了解药物的清除途径。如果这些主要 CYP 酶不参与药物的代谢，则应评估其他 I 期和 II 期酶，包括：

反应表型提供有关测试物质代谢分数的信息，可用于评估受体 DDI 潜力、为临床研究设计提供信息、预测药代动力学的个体变异性以及评估遗传多态性的影响。

测试系统：混合的人肝微粒体和具有所需辅助因子的重组单独表达的人酶
CYP 亚型： CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4。（其他 CYP、UGT 和药物代谢酶也可用）。
亚型特异性化学抑制剂和重组酶用于确认。

将测试物质与微粒体在磷酸盐缓冲液中至少预孵育 5 分钟。测试物质的代谢是通过添加 NADPH 或其他适当的辅助因子来启动的。通过添加有机溶剂终止孵育，然后使用液相色谱–质谱（LC-MS）分析样品的测试物质和/或其代谢物。

第一阶段 - 体外孵育条件的优化

在 NADPH 或其他适当辅助因子存在下，将具有一定微粒体浓度（通常为 0.1-1 mg 蛋白质/mL）的测试物质进行三次重复孵育，四个时间点长达 60 分钟。

在没有辅助因子的情况下进行对照孵育。产生线性测试物质消失速率的微粒体浓度和时间点的孵育条件用于定义后续实验。

第二阶段 - 测试物品代谢的动力学分析

在优化条件下，在孵育样品中监测测试物质消失的速度，至少有八种浓度的测试物质，进行三次重复。使用 Michaelis-Menten 曲线拟合分析数据，并确定测试物品的动力学参数 K_m 和 V_max 。

III 期 - 使用 CYP 特异性化学抑制剂进行抑制分析

将测试物品以低于 Km 的浓度与混合人肝微粒体孵育，分别在有或没有酶选择性化学抑制剂的情况下进行，一式三份。在没有抑制剂的情况下仅使用载体溶剂进行对照孵育。

IV 期 - 使用重组人 CYP 进行代谢

将测试物品一式三份以浓度小于 Km 与一系列重组人 CYPs 和 UGTs 以及其他 DME（见上文）孵育。测量测试物品在 0 分钟和 60 分钟时的相对浓度。

这些测定将确定负责测试物品在体外代谢的酶和代谢程度。确定测试物品消失和/或代谢物形成的动力学。体外代谢评估可识别所涉及的主要酶，并在首次人体测试之前提醒您潜在的体内清除机制风险。