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Phénotypage réactionnel

Des études de phénotypage réactionnel évaluent l’impact d’inhibiteurs spécifiques d’isoformes enzymatiques sur la disparition d’un article de test parent incubé dans des microsomes hépatiques humains regroupés. L’incubation avec des isoformes individuelles recombinantes d’enzymes métabolisant des médicaments fournit une confirmation des activités enzymatiques. L’évaluation des enzymes responsables du métabolisme d’un article d’essai peut mettre en évidence des passifs potentiels tels que des voies métaboliques catalysées par des enzymes uniques ou par des enzymes exprimées de manière polymorphe.

  • Conformité réglementaire

  • Évaluation enzymatique complète

  • Inhibiteurs chimiques spécifiques des isoformes et enzymes recombinantes

Considérations réglementaires pour les études de phénotypage réactionnel

L’étude des enzymes CYP (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 et CYP3A) est recommandée comme étude initiale afin de mieux comprendre les voies d’élimination du médicament conformément aux lignes directrices sur les interactions médicamenteuses (DDI). Si ces enzymes majeures du CYP ne sont pas impliquées dans le métabolisme du médicament, d’autres enzymes de phase I et de phase II doivent être évaluées, notamment :

  • Enzymes CYP (CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 et CYP2E1)
  • Enzymes non-CYP, y compris l’aldéhyde oxydase (AO), la carboxylestérase (CES), la monoamine oxydase (MAO), la flavine monooxygénase (FMO), la xanthine oxydase (XO) et l’alcool/aldéhyde déshydrogénase (ADH/ALDH)
  • Enzymes conjugatives, y compris les UDP glucuronosyl transférases (UGT) et les sulfotransférases (SULT)

Le phénotypage réactionnel fournit des informations sur la fraction métabolisée des articles testés et peut être utilisé pour évaluer le potentiel d'interaction médicamenteuse de la victime, éclairer la conception des études cliniques, prédire la variabilité individuelle de la pharmacocinétique et évaluer l’impact du polymorphisme génétique.

Méthodes

  • Système d’essai : Microsomes hépatiques humains regroupés et enzymes humaines recombinantes exprimées individuellement avec les cofacteurs requis
  • Isoformes du CYP : CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 et CYP3A4. (D’autres CYP, UGT et enzymes métabolisant les médicaments sont également disponibles).
  • Des inhibiteurs chimiques spécifiques des isoformes et des enzymes recombinantes sont utilisés pour la confirmation.

L’article d’essai est pré-incubé pendant au moins 5 minutes avec des microsomes dans un tampon phosphate. Le métabolisme de l’article d’essai est déclenché par l’ajout de NADPH ou d’un autre cofacteur approprié. Les incubations sont terminées par l’ajout d’un solvant organique et les échantillons sont ensuite analysés pour l’article d’essai et/ou ses métabolites à l’aide de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS).

Phase I - Optimisation des conditions d’incubation in vitro

L’article d’essai est incubé en trois exemplaires avec une gamme de concentrations de microsomes (généralement de 0,1 à 1 mg de protéines/mL) pendant quatre points temporels jusqu’à 60 minutes en présence de NADPH ou d’un autre cofacteur approprié.

Les incubations témoins sont effectuées en l’absence de cofacteur. Les conditions d’incubation de la concentration microsomale et du point temporel qui produisent un taux linéaire de disparition de l’article d’essai sont utilisées pour définir les expériences de suivi.

Phase II - Analyse cinétique du métabolisme de l’article d’essai

La vitesse à laquelle l’article d’essai disparaît est surveillée dans les échantillons d’incubation avec au moins huit concentrations de l’article d’essai en trois exemplaires dans des conditions optimisées. Les données sont analysées à l’aide de l’ajustement de la courbe de Michaelis-Menten, et les paramètres cinétiques K m  et Vmax  sont déterminés pour l’article d’essai.

Phase III - Analyse de l’inhibition à l’aide d’inhibiteurs chimiques spécifiques du CYP

L’article d’essai est incubé en trois exemplaires à une concentration <Km avec des microsomes hépatiques humains regroupés en l'absence ou en présence des inhibiteurs chimiques sélectifs de l'enzyme. Les incubations témoins sont effectuées en l’absence de l’inhibiteur en utilisant uniquement le solvant véhicule.

Phase IV - Métabolisme à l’aide de CYP humains recombinants

L’article d’essai est incubé en trois exemplaires à une concentration <Km avec une gamme de CYP humains recombinants et UGT, et d'autres DME (voir ci-dessus). La concentration relative de l’article d’essai à 0 et 60 minutes est mesurée. 

 

Résultats attendus

Ces essais permettront d’identifier les enzymes responsables du métabolisme de l’article d’essai et de l’étendue de celui-ci in vitro. La cinétique de la disparition de l’article d’essai et/ou de la formation de métabolites est déterminée. L’évaluation in vitro du métabolisme identifie les principales enzymes impliquées et vous avertit des risques potentiels liés au mécanisme de clairance in vivo avant le premier essai chez l’homme.