Zum Hauptinhalt wechseln

Reaktions-Phänotypisierung

Reaktionsphänotypisierungsstudien untersuchen den Einfluss von enzymisoformspezifischen Inhibitoren auf den Abbau einer Ausgangsverbindung, die in gepoolten menschlichen Lebermikrosomen inkubiert wurde. Die Inkubation mit rekombinanten individuellen arzneimittelmetabolisierenden Enzymisoformen liefert die Bestätigung der Enzymaktivitäten. Die Bewertung der Enzyme, die für die Metabolisierung eines Versuchsobjekts verantwortlich sind, kann potenzielle Risiken aufzeigen, wie z. B. Stoffwechselwege, die durch einzelne Enzyme oder durch polymorph exprimierte Enzyme katalysiert werden.

  • Regulatorische Konformität

  • Umfassende Enzymbewertung

  • Isoformspezifische chemische Inhibitoren und rekombinante Enzyme

Regulatorische Überlegungen für Reaktionsphänotypisierungsstudien

Die Untersuchung von CYP-Enzymen (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 und CYP3A) wird als erste Untersuchung empfohlen, um die Clearance-Wege des Arzneimittels gemäß den Richtlinien für Arzneimittel-Wechselwirkungen (DDI) besser zu verstehen. Wenn diese wichtigen CYP-Enzyme nicht am Metabolismus des Arzneimittels beteiligt sind, sollten andere Phase-I- und Phase-II-Enzyme bewertet werden, darunter:

  • CYP-Enzyme (CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 und CYP2E1)
  • Nicht-CYP-Enzyme, einschließlich Aldehydoxidase (AO), Carboxylesterase (CES), Monoaminoxidase (MAO), Flavinmonooxygenase (FMO), Xanthinoxidase (XO) und Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase (ADH/ALDH)
  • Konjugative Enzyme einschließlich UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT) und Sulfotransferasen (SULTs)

Die Reaktionsphänotypisierung liefert Informationen über den metabolisierten Anteil von Testartikeln und kann zur Beurteilung des DDI-Potenzials des betroffenen Arzneimittels, zur Unterstützung des klinischen Studiendesigns, zur Vorhersage der individuellen Variabilität in der Pharmakokinetik und zur Bewertung des Einflusses genetischer Polymorphismus verwendet werden.

Methoden

  • Prüfsystem: Gepoolte humane hepatische Mikrosomen und rekombinante, individuell exprimierte humane Enzyme mit den erforderlichen Cofaktoren
  • CYP-Isoformen: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4. (Andere CYPs, UGTs und arzneimittelmetabolisierende Enzyme sind ebenfalls verfügbar).
  • Zur Bestätigung werden isoformspezifische chemische Inhibitoren und rekombinante Enzyme verwendet.

Der Testling wird für mindestens 5 Minuten mit Mikrosomen in Phosphatpuffer vorinkubiert. Der Metabolismus des Testartikels wird durch Zugabe von NADPH oder einem anderen geeigneten Cofaktor eingeleitet. Die Inkubationen werden durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels beendet und die Proben anschließend mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) auf den Testartikel und/oder seine Metaboliten analysiert.

Phase I - Optimierung der in vitro Inkubationsbedingungen

Der Testartikel wird in dreifacher Ausführung mit einer Reihe von Mikrosomenkonzentrationen (typischerweise 0,1 – 1 mg Protein/ml) für vier Zeitpunkte bis zu 60 Minuten in Gegenwart von NADPH oder einem anderen geeigneten Cofaktor inkubiert.

Kontrollinkubationen werden in Abwesenheit eines Cofaktors durchgeführt. Die Inkubationsbedingungen der mikrosomalen Konzentration und des Zeitpunkts, die eine lineare Rate des Verschwindens der Prüfsubstanz erzeugen, werden verwendet, um Folgeexperimente zu definieren.

Phase II - Kinetische Analyse des Metabolismus der Prüfsubstanz

Die Geschwindigkeit, mit der die Prüfsubstanz verschwindet, wird in den Inkubationsproben mit mindestens acht Konzentrationen der Prüfsubstanz in dreifacher Ausführung unter optimierten Bedingungen überwacht. Die Daten werden mittels Michaelis-Menten-Kurvenanpassung analysiert und die kinetischen Parameter Km  und Vmax  für den Testartikel bestimmt.

Phase III - Inhibitionsanalyse mit CYP-spezifischen chemischen Inhibitoren

Der Testartikel wird in dreifacher Ausfertigung bei einer Konzentration von <Km mit gepoolten menschlichen Lebermikrosomen in Abwesenheit oder Anwesenheit der enzymselektiven chemischen Inhibitoren inkubiert. Kontrollinkubationen werden in Abwesenheit des Inhibitors nur mit Vehikellösungsmittel durchgeführt.

Phase IV - Metabolismus mit rekombinanten humanen CYPs

Der Prüfling wird in dreifacher Ausfertigung bei einer Konzentration von <Km mit einer Reihe von rekombinanten menschlichen CYPs und UGTs und anderen DME (siehe oben) inkubiert. Gemessen wird die relative Konzentration des Prüflings nach 0 und 60 Minuten. 

 

Lieferumfang

Diese Assays identifizieren in vitro die Enzyme, die für den Metabolismus des Prüflings verantwortlich sind, und das Ausmaß des Metabolismus. Die Kinetik des Verschwindens des Prüflings und/oder die Metabolitenbildung werden bestimmt. Die In-vitro-Bewertung des Metabolismus identifiziert die wichtigsten beteiligten Enzyme und warnt Sie vor dem ersten Test am Menschen vor möglichen Risiken im Zusammenhang mit dem In-vivo-Clearance-Mechanismus.